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文檔簡介
1、表皮干細胞(keratinocytestemcell,KSC)位于表皮基底層,具有強大的增殖潛能,可分化形成全層表皮,并具有產生皮膚附件的作用,是潛在的多能干細胞。由于表皮干細胞數量少,而且體外培養(yǎng)很容易分化,所以對培養(yǎng)KSC的生物學特性進行深入研究具有重要的意義。探究如何在體外培養(yǎng)獲得足夠數量的KSC用于研究及移植、如何在體內外誘導KSC定向分化是KSC研究的又一重要課題,解決這些問題的關鍵在于研究KSC增殖與分化的調控機制。
2、 本室先期已對不同來源皮膚中的KSC的定位分布進行了研究,對KSC進行了初步的分離培養(yǎng)。本研究主要探討分離純化人KSC的方法,觀察KSC在體外培養(yǎng)條件下的生長及分化特性。針對目的基因整合素β1(integrinβ1)構建siRNA表達質粒并鑒定,探討下調KSC中整合素β1的表達對KSC增殖與分化的影響。 將人表皮細胞接種在Ⅳ型膠原包被的培養(yǎng)瓶中粘附10min,取粘附的類KSC以低密度接種于滋養(yǎng)層上,培養(yǎng)14d后挑選KSC克隆分散
3、培養(yǎng),觀察其克隆再形成率,通過免疫細胞熒光染色法檢測培養(yǎng)KSC中interginβ1及involucrin的表達水平,分析其細胞周期。將一個KSC克隆的所有子代細胞消化后接種,連續(xù)傳代,培養(yǎng)14d后計算克隆形成率(CFE),觀察KSC子代細胞的總體分化情況。 針對目的基因integrinβ1選擇了兩個RNAi作用靶點,構建到pSilencer3.1/H1-Hygro載體上,通過酶切及測序鑒定重組陽性質粒。將低密度接種的KSC克隆
4、挑選出來分散后接種,待細胞長至60%左右匯合時轉染,用不同比例脂質體轉染試劑Dotap介導轉染不同劑量報告基因EGFP,優(yōu)化轉染條件。重組陽性質粒轉染人KSC,通過定量westernblot、半定量RT-PCR檢測對目的基因的抑制效率,篩選出最有效的RNAi作用靶點,將其重組質粒命名為siIntegrinβ1。 重組質粒siIntegrinβ1轉染人KSC48~72h后,提取細胞總蛋白及總RNA,通過定量westernblot、
5、半定量RT-PCR檢測對目的基因的抑制效率;并對RNAi后KSC行細胞周期分析。挑選RNAi后48~72h的KSC克隆分散后接種于滋養(yǎng)層上,培養(yǎng)14d后用1%羅丹藍染色計算CFE,觀察下調integrinβ1的表達對KSC增殖與分化的影響,并設有效的對照組(非轉染組、轉染pSilencer3.1/H1組、轉染siNegative組)。 研究發(fā)現,利用Ⅳ型膠原快速粘附法富集KSC,結合低密度單克隆挑選可以提高KSC篩選效率及純度。
6、KSC在培養(yǎng)過程中可見三種克隆形態(tài)共存的現象:即全克隆(holoclone)、短暫增殖克隆(meroclone)、終末克隆(paraclone)。只有全克隆可以連續(xù)傳代,并進一步增殖分化出所有三種類型的克隆,其他克隆不能傳代培養(yǎng)。KSC克隆的子代細胞在體外培養(yǎng)會逐漸發(fā)生分化,但仍保留一定比例的干細胞數。 載體介導的RNAi技術能夠下調KSC中integrinβ1的表達。針對靶基因integrinβ1設計和構建了兩個重組質粒siI
7、ntegrinβ1-1和siIntegrinβ1-2,并轉染人KSC,能夠不同程度的下調integrinβ1的蛋白表達,其中靶點二的抑制效率高于靶點一,抑制效率達到了60~70%。提示H1啟動子介導的細胞內合成siRNA策略,能夠成功地在KSC中應用,為進一步研究integrinβ1在KSC中的功能奠定了基礎。 RNAi技術干擾整合素β1基因表達可促進KSC分化。挑取RNAi后48~72h的KSC克隆,培養(yǎng)14d后計算克隆再形成
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