Wnt-1的生物信息學分析及其對人表皮干細胞分化與增殖的影響的研究.pdf

1、表皮干細胞是皮膚組織特異性干細胞，位于表皮基底層，在維持表皮更新，保持細胞恒定等方面起著重要作用，它也是皮膚及其附屬器官發(fā)生、修復、改建的關鍵性源泉。表皮干細胞的增殖與分化不僅為自身基因所預先設置，還受到干細胞“壁龕”(Niche)的調(diào)控。Wnt家族是干細胞“壁龕”中重要的組成部分，參與細胞分化、細胞極性、細胞遷移以及細胞增殖等過程。其中，Wnt-1在神經(jīng)上皮的發(fā)育、乳腺癌的發(fā)生等上皮性組織的發(fā)育與分化的過程中扮演著重要的角色。Wnt-

2、1的表達與皮膚及其附屬器的發(fā)育在時相上一致：Wnt-1在胚胎時期表達活躍，而成年時多處于相對靜止狀態(tài)；人表皮干細胞于胎齡24周時形成成熟的腺體，而在成年人的創(chuàng)口愈合處，則不能再生為任何腺體，提示表皮及其附屬腺體的發(fā)育與Wnt-1的表達有很大的關系?；诖耍覀冊诒菊n題里進行了Wnt-1影響人表皮干細胞分化與增殖的相關研究。 在本課題中，我們基于“結(jié)構(gòu)決定功能”的思想，首先以生物信息學的手段和方法，對Wnt-1進行氨基酸序列分析、

3、二級結(jié)構(gòu)預測和理化性質(zhì)分析，以期獲得對Wnt-1的分子水平的了解。在研究Wnt-1對人表皮干細胞的分化與增殖的影響時，我們借助了重組腺病毒基因?qū)爰夹g將Wnt-1導入到人表皮干細胞內(nèi)。這是因為Wnt-1是一種不穩(wěn)定蛋白，在生理條件下極易降解，添加外源性Wnt-1蛋白至細胞培養(yǎng)基中，難以維持其濃度的穩(wěn)定，且會增加組間誤差和組內(nèi)誤差。在人表皮干細胞內(nèi)表達Wnt-1蛋白前后，我們檢測了其增殖能力、標記性分子、基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2和：MMP

4、-7濃度、細胞內(nèi)Ca2+濃度等多項指標，以研究Wnt-1對人表皮干細胞分化與增殖的影響。 第一部分：Writ-1的生物信息學分析 目的：全面分析Wnt-1蛋白的生物信息學特征 方法：首先，從NCBI上摘錄Wnt家族的全部氨基酸序列，以Phylip和Treeview軟件繪制該家族的系統(tǒng)進化樹；然后，以ExPASY網(wǎng)站提供的生物信息學分析模塊和本地Anthprot生物信息學分析軟件對Wnt-1的氨基酸組成成分、等電點

5、、信號肽切割位點、滴定曲線等進行分析；以GOR4、HNN、SOPMA三種方法預測Wnt-1的二級結(jié)構(gòu)；以ExPASY網(wǎng)站相關模塊分析Wnt-1的親水性、極性以及折返系數(shù)；最后對這些結(jié)果進行比對和分析。 結(jié)果：Wnt家族中，Wnt-4、Wnt-11和Wnt-16單獨存在，其他的成員均成對存在；Wnt-1與Wnt-6配對，二者親緣關系最近。Wnt-1整體略帶正電荷；不穩(wěn)定指數(shù)為62.61，為一種不穩(wěn)定蛋白；整體親水性指數(shù)為.-0.3

6、47，為一種疏水性蛋白；等電點約在9.0附近；信號肽為一條含27個氨基酸的短肽。GOR4、HNN、SOPMA三種二級結(jié)構(gòu)預測方法均認為Wnt-1的第25～50、112～172、222～238、272～360位區(qū)域主要由不規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)和伸展結(jié)構(gòu)所構(gòu)成。親水性、極性以及折返系數(shù)分析結(jié)果均提示：第59～69、89～102、150～160、175～195、209～220、335～342位區(qū)域的量化指標高于閾值。 結(jié)論：Wnt-1與Wnt

7、-6配對存在；Wnt-1在生理條件下不穩(wěn)定；Wnt-1蛋白第150～160和335～342兩個區(qū)域既符合功能結(jié)構(gòu)域的空間構(gòu)成要素，又符合理化構(gòu)成要素，最有可能成為其功能結(jié)構(gòu)域。 第二部分：Writ-1重組腺病毒的構(gòu)建 目的：構(gòu)建Wnt-1重組腺病毒顆粒 方法：從其他研究者取得已經(jīng)構(gòu)建好的，經(jīng)測序證實序列無誤的重組穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV/Wnt-1，將其線性化后在BJ5183細菌中和腺病毒骨架質(zhì)粒pAdE

8、asy-1重組，構(gòu)建成重組腺病毒質(zhì)粒pAdEasy-1/Wnt-1；使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒將重組腺病毒質(zhì)粒pAdEasy-1/Wnt-1導入QBI-293A細胞中，借助該細胞中提供的反式補償，產(chǎn)生具有普遍感染能力的pAdEasy-1/Wnt-1重組腺病毒顆粒。最后，對這些病毒顆粒進行大量擴增，以滿足下一步實驗之用。 結(jié)果：重組腺病毒質(zhì)粒pAdEasy-1/Wnt-1構(gòu)建完成后，以PacI酶切后，可見一條遠大于15Kb的明亮條帶和一

9、條約4.5Kb的條帶，與理論值完全吻合，證明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功；以該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染QBI-293A細胞后，可觀察到綠色熒光蛋白的表達，證明產(chǎn)生了攜帶Wnt-1重組穿梭質(zhì)粒的腺病毒顆粒；經(jīng)大量擴增，最終獲得足夠的pAdEasy-1/Wnt-1重組腺病毒顆粒。 結(jié)論：Wnt-1重組腺病毒顆粒構(gòu)建成功。 第三部分：Wnt-1對人表皮干細胞分化與增殖的影響的研究 目的：研究Wnt-1對人表皮干細胞分化與增殖的影響 方法：

10、首先，以Ⅳ型膠原快速粘貼法獲得人表皮干細胞，并借助重組腺病毒技術將Wnt-1基因?qū)肴吮砥じ杉毎浑S后觀察綠色熒光蛋白的表達，并以RT-PCR法檢測Wnt-1mRNA在人表皮干細胞中的存在；最后以CASYexcell系統(tǒng)檢測人表皮干細胞的增殖能力，以免疫組化法檢測角蛋白K5、K6、K7、K8、K10、K18、K19以及CD44、CEA、ER、PR等標記性分子的表達，以ELISA法檢測細胞培養(yǎng)基中基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2和MMP-7的濃度

11、，以激光共聚焦技術檢測細胞內(nèi)Ca2+濃度。 結(jié)果：分離獲取的人表皮干細胞在接種后第4天進入快速生長期，第8天時到達平臺期；Wnt-1基因?qū)肴吮砥じ杉毎?，可觀察到綠色熒光蛋白的表達，RT-PCR也檢測到了Wnt-1mRNA的存在，故以雙重標準證明了Wnt-1基因在人表皮干細胞中的存在與表達；CASYexcell系統(tǒng)檢測后發(fā)現(xiàn)，人表皮干細胞直徑無明顯變化，而細胞增殖則明顯加強；人表皮干細胞角蛋白K10的表達由陰性變?yōu)殛栃?，K18