創(chuàng)面收集液對(duì)表皮干細(xì)胞增殖分化的影響及其分子機(jī)制初探.pdf

1、有關(guān)創(chuàng)面愈合的研究是一個(gè)既古老又新穎的課題。皮膚創(chuàng)傷愈合又是一個(gè)異常復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程，有多種修復(fù)細(xì)胞、炎癥細(xì)胞及細(xì)胞因子參與。這些細(xì)胞和細(xì)胞因子之間有著復(fù)雜的調(diào)控關(guān)系。它涉及細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、粘附、通訊、增殖和分化等細(xì)胞生物學(xué)的多個(gè)方面。既往對(duì)創(chuàng)面的研究往往集中在真皮層的修復(fù)與創(chuàng)面床的改建上，而較少涉及表皮再生。隨著對(duì)各種干細(xì)胞研究的不斷深入，研究表明，多種干細(xì)胞對(duì)創(chuàng)傷的修復(fù)起到關(guān)鍵的作用。表皮干細(xì)胞(epidermal stem cells，

2、ESC)作為皮膚組織的特異性干細(xì)胞，不僅維持表皮組織日常的新陳代謝，而且與創(chuàng)面的愈合緊密相關(guān)，被認(rèn)為是皮膚及其附屬器修復(fù)的源泉細(xì)胞。然而，ESC與創(chuàng)面愈合間的確切關(guān)系尚知而不詳。盡管我們?cè)谝酝南嚓P(guān)研究中發(fā)現(xiàn)了ESC的異位現(xiàn)象與創(chuàng)面愈合密切相關(guān)，但ESC為何發(fā)生異位、以及細(xì)胞間的網(wǎng)絡(luò)信號(hào)系統(tǒng)是如何調(diào)控這一過(guò)程的，均有待于作出回答，這也是實(shí)現(xiàn)創(chuàng)面完美愈合最終目標(biāo)的重要環(huán)節(jié)。 本研究以體外培養(yǎng)的ESC為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，通過(guò)全層皮膚創(chuàng)面收集

3、液(wound harvestedeffusion，WHE)的干預(yù)，觀察了其對(duì)ESC增殖、分化的影響；并在ESC表型改變的過(guò)程中，動(dòng)態(tài)地觀察了表皮干細(xì)胞內(nèi)Ca<'2+>濃度的變化，以及MAPKs信號(hào)通路系統(tǒng)對(duì)細(xì)胞內(nèi)Ca<'2+>的影響，初步探討了兩者之間可能存在的調(diào)控作用。 本研究的主要研究?jī)?nèi)容與結(jié)論如下： 為避免在體復(fù)雜因素的干擾，以全層創(chuàng)面收集液作為單一影響因子探討其對(duì)表皮干細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，用聚氨酯海綿收集成年

4、wistar大鼠背部全層創(chuàng)面滲出液；快速粘附分離法體外分離、培養(yǎng)新生wistar大鼠的表皮干細(xì)胞，待表皮干細(xì)胞呈克隆生長(zhǎng)時(shí)，加入創(chuàng)面收集液干預(yù)，分別于干預(yù)后的0、6、12、18、24、30、36、42、48、54、60、72 h采用流式細(xì)胞儀及β<,1>整合素、角蛋白19、14、10免疫組化染色進(jìn)行細(xì)胞增殖、分化的鑒定。結(jié)果顯示，表皮干細(xì)胞在創(chuàng)面收集液干預(yù)后仍可持續(xù)保持片狀聚集生長(zhǎng)的態(tài)勢(shì)，但出現(xiàn)數(shù)量較多的K14陽(yáng)性染色細(xì)胞群落，且隨時(shí)間

5、延長(zhǎng)該陽(yáng)性細(xì)胞群落呈上升趨勢(shì)；另出現(xiàn)了散在的的K10染色陽(yáng)性細(xì)胞。以上結(jié)果提示，創(chuàng)面收集液可以快速誘導(dǎo)體外培養(yǎng)表皮干細(xì)胞進(jìn)入分化狀態(tài)，且多表現(xiàn)為短暫擴(kuò)充細(xì)胞表型，在該過(guò)程中表皮干細(xì)胞數(shù)量仍可維持一定的水平。 為探討創(chuàng)面收集液對(duì)表皮干細(xì)胞(ESC)內(nèi)鈣離子的作用以及絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路對(duì)胞內(nèi)游離鈣的影響，將培養(yǎng)的表皮干細(xì)胞分為5組：①單純對(duì)照組；②單純創(chuàng)面收集液處理組；③PD98059阻斷劑+創(chuàng)面收集液處理組；④SB

6、203580阻斷劑+創(chuàng)面收集液處理組；⑤PD98059與SB203580阻斷劑+創(chuàng)面收集液處理組。應(yīng)用特異性Ca<'2+>熒光指示劑Fluo-3/AM負(fù)載細(xì)胞，激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Ca<'2+>熒光強(qiáng)度，以判斷游離鈣的濃度。結(jié)果顯示，單純創(chuàng)面收集液處理組ESC的Ca<'2+>熒光強(qiáng)度明顯較單純對(duì)照組增加；③、④兩組均出現(xiàn)了不同的鈣振蕩現(xiàn)象；而⑤組則表現(xiàn)為Ca<'2+>熒光強(qiáng)度的迅速降低。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，創(chuàng)面收集液可致ESC游離Ca<