胚胎肝干細(xì)胞的增殖、分化及其調(diào)控因素.pdf

1、由于肝干細(xì)胞具有自我復(fù)制和雙向分化潛能，故肝干細(xì)胞可望成為嚴(yán)重肝疾患細(xì)胞替代療法以及構(gòu)成生物人工肝的供體細(xì)胞，也因此使其成為當(dāng)前的一個(gè)研究熱點(diǎn)。 Suzuki、Dabeva、Allain、Malli等人分別利用FACS方法從大鼠、小鼠、獼猴和人胚胎肝中分離出的肝干細(xì)胞，在體外進(jìn)行單細(xì)胞克隆培養(yǎng)，觀察其分化潛能、細(xì)胞的形態(tài)特征及其所表達(dá)的標(biāo)志物。 Jung等在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)上觀察到，來(lái)自心肌細(xì)胞的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Fibrob

2、lastgrowthfactor，F(xiàn)GF)信號(hào)可誘導(dǎo)alb和afp等肝特異基因的表達(dá)。Matsumoto等提出在肝內(nèi)血管形成和發(fā)揮功能之前，橫隔間充質(zhì)中的內(nèi)皮細(xì)胞就對(duì)肝芽的形成提供了重要的生長(zhǎng)信號(hào)。Parviz等利用基因剔除的小鼠模型，發(fā)現(xiàn)肝干細(xì)胞的增殖、分化受肝細(xì)胞核因子4α(Hepatocytenuclearfactor4α，HNF4α)、HNF6、HEX、含亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域的CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α (CCAAT/en

3、hancerbindingproteinα，C/EBPα)等轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控?？傊陙?lái)肝干細(xì)胞的研究雖然取得了很大的進(jìn)展，但還存在許多有待解決的問(wèn)題。對(duì)于肝干細(xì)胞在胚胎肝發(fā)育過(guò)程中的形態(tài)學(xué)特征、時(shí)空分布、分化過(guò)程的報(bào)道很少；對(duì)心肌細(xì)胞、橫隔間充質(zhì)細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)肝發(fā)育的誘導(dǎo)的分子機(jī)制不清楚；對(duì)于造血細(xì)胞對(duì)肝干細(xì)胞的發(fā)育有無(wú)影響未見(jiàn)報(bào)道。對(duì)人胚胎肝干細(xì)胞的研究資料尤為缺乏，而對(duì)人胚胎肝干細(xì)胞的研究，所得資料直接反映其生物學(xué)特征，避免

4、了用模式生物進(jìn)行研究所得的資料還需要在人體再加證實(shí)的過(guò)程，結(jié)果可望直接用于肝干細(xì)胞的應(yīng)用研究及其臨床應(yīng)用。因此本研究擬觀察下述內(nèi)容，以探討肝干細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征、增殖分化過(guò)程以及調(diào)控肝干細(xì)胞增殖、分化的微環(huán)境。 ①觀察第3～12周人胚胎肝干細(xì)胞的時(shí)空分布、形態(tài)學(xué)特征、表型及增殖、分化過(guò)程。 ②觀察由心肌細(xì)胞、橫隔間充質(zhì)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞及造血細(xì)胞等合成的、可能對(duì)肝干細(xì)胞增殖、分化起調(diào)節(jié)作用的因子的時(shí)空表達(dá)。③肝干細(xì)胞在增殖

5、分化過(guò)程中自我合成、分泌的因子的時(shí)空表達(dá)。④肝細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子HNF4α和HNF6在發(fā)育各期小鼠胚胎肝干細(xì)胞的表達(dá)時(shí)相和細(xì)胞定位。 1.材料與方法1.1標(biāo)本的收集、處理及胚胎齡的判斷收集受精齡為3月以內(nèi)的新鮮人胚胎標(biāo)本228例，常規(guī)石蠟包埋、連續(xù)切片，HE染色，根據(jù)體節(jié)的數(shù)目及器官發(fā)育狀況確定胚胎齡。1.2形態(tài)觀察①胚胎肝與原始橫隔和心臟在發(fā)育過(guò)程中的位置關(guān)系。 ②肝干細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征和增殖、分化過(guò)程。 ③血管內(nèi)皮

6、細(xì)胞、造血細(xì)胞、心肌細(xì)胞及橫隔間充質(zhì)細(xì)胞形態(tài)變化和增殖、分化過(guò)程。 1.3免疫組化染色AFP、c-Met、CK19、PCNA、CD10、CD14、CD34、HGF、IGF-I、TGFβ1、VEGFA、VEGFC及其受體，共20種抗體免疫組化染色，觀察它們?cè)诟胃杉?xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、造血細(xì)胞、心肌細(xì)胞及橫隔間充質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)，以了解：①肝干細(xì)胞的表型特征。 ②相鄰的心肌細(xì)胞、橫隔間充質(zhì)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和造血細(xì)胞對(duì)肝干細(xì)胞增

7、殖、分化的影響。 ③通過(guò)觀察上述因子和受體在不同類(lèi)型細(xì)胞中的時(shí)空表達(dá)，了解這些因子的作用方式和作用時(shí)相。 1.4RT-PCR法和原位雜交：觀察肝細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子HNF4αmRNA和HNF6mRNA在發(fā)育各階段小鼠肝中的表達(dá)，了解HNF4α和HNF6在小鼠胚胎肝干細(xì)胞增殖、分化過(guò)程中的作用。 2.結(jié)果與討論2.1肝干細(xì)胞的觀察第3～5W人胚肝細(xì)胞排列緊密，較小，形態(tài)不規(guī)則，核圓形或卵圓形，核質(zhì)比例大，核深染，胞質(zhì)顏色

8、較淡，偏藍(lán)色，顯示出幼稚細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征，并呈甲胎蛋白(α-Fetoprotein，AFP)、c-Met陽(yáng)性反應(yīng)，提示為肝干細(xì)胞。第6～9W開(kāi)始肝索內(nèi)出現(xiàn)了體積大、核大、淡染的細(xì)胞，表明此階段肝干細(xì)胞已經(jīng)處于分化階段，生成了肝細(xì)胞，而肝干細(xì)胞的數(shù)量逐漸下降，在胚胎肝內(nèi)彌散分布。第10～12W，AFP、c-Met陽(yáng)性細(xì)胞主要分布于匯管區(qū)周?chē)?，提示此時(shí)肝干細(xì)胞主要局限于匯管區(qū)周?chē)母嗡鲀?nèi)，與成年肝中卵圓細(xì)胞(成年肝干細(xì)胞)的分布一致。說(shuō)明第

9、10～12W肝小葉形成后，肝干細(xì)胞的分布與成年肝干細(xì)胞的位置相似，并可能一直保留在此處。細(xì)胞角蛋白19(cytokertin19，CK19)陽(yáng)性反應(yīng)在第7W時(shí)開(kāi)始出現(xiàn)。第10～11W時(shí)，CK19陽(yáng)性反應(yīng)主要位于匯管區(qū)附近的肝索細(xì)胞和膽管板細(xì)胞及膽管上皮細(xì)胞。第12W時(shí)，CK19陽(yáng)性信號(hào)僅見(jiàn)于膽管板和膽管上皮細(xì)胞。此時(shí)所有的膽管板細(xì)胞及膽管上皮細(xì)胞均呈AFP、c-Met和CK19陽(yáng)性，因此AFP+/c-Met+/CK19+細(xì)胞可能為膽管祖

10、細(xì)胞。 2.2生長(zhǎng)因子及其受體在肝干細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、造血細(xì)胞、 心肌細(xì)胞和橫隔間充質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)人胚胎第3～10W肝干細(xì)胞不表達(dá)肝生長(zhǎng)因子(Hepatocytegrowthfacto，HGF)，但表達(dá)HGF的受體c-Met，而此時(shí)鄰近的造血細(xì)胞、心肌細(xì)胞、橫隔間充質(zhì)細(xì)胞為HGF免疫反應(yīng)陽(yáng)性，提示造血細(xì)胞、心肌細(xì)胞、橫隔間充質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的HGF可能通過(guò)旁分泌途徑與肝干細(xì)胞表達(dá)的c-Met結(jié)合，為人胚胎肝干細(xì)胞提供生長(zhǎng)信號(hào)。H

11、GF/c-Met系統(tǒng)在肝內(nèi)的表達(dá)早于其他生長(zhǎng)因子，在肝芽生成階段即出現(xiàn)，并且一直維持較高水平的c-Met，因此本文推測(cè)HGF可能在人胚肝發(fā)育的啟動(dòng)和肝干細(xì)胞的增殖分化過(guò)程中都起到重要作用。 第3～4W時(shí)，胰島素樣生長(zhǎng)因子1(Insulin-likegrowthfactorI，IGF-I)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(transforminggrowthfactor-betal，TGF-B1)及其受體在肝索細(xì)胞、造血細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞中均無(wú)表達(dá)。第

12、5～12W，可觀察到肝索細(xì)胞、造血細(xì)胞、心肌細(xì)胞以及橫隔間充質(zhì)細(xì)胞為IGF-I及其受體IGF-IR、TGFB1及其受體TGFBR1、TGFBR2陽(yáng)性反應(yīng)。提示IGF-I、TGFβ1可能在人胚肝發(fā)生的啟動(dòng)階段無(wú)明顯作用，與Randal等的報(bào)道不同。在5W之后，造血細(xì)胞、心肌細(xì)胞及橫隔間充質(zhì)細(xì)胞分泌的IGF-I、TGFβ1等可能通過(guò)旁分泌途徑調(diào)節(jié)肝干細(xì)胞的增殖、分化，同時(shí)，肝干細(xì)胞本身產(chǎn)生的IGF-I、TGFβ1也可通過(guò)自分泌途徑發(fā)揮作用。

13、其中IGF-I的作用可能協(xié)同HGF的促增殖作用，TGFβ1可通過(guò)旁分泌和自分泌途徑抑制肝干細(xì)胞數(shù)目的過(guò)度增加、并促進(jìn)其分化。 胚胎第3～12W的橫隔間充質(zhì)細(xì)胞、心肌細(xì)胞呈血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子A(VascularendothelialgrowthfactorA，VEGFA)強(qiáng)陽(yáng)性，而其受體fms樣酪氨酸激酶(fms-liketyrosinekinase，flt1)和胎肝激酶1(fetalliverkinasel，flk1)在肝干細(xì)

14、胞中均有表達(dá)。這說(shuō)明心肌細(xì)胞和橫隔間充質(zhì)細(xì)胞分泌的VEGFA可通過(guò)旁分泌途徑調(diào)節(jié)肝干細(xì)胞的增殖、分化。此時(shí)造血細(xì)胞亦表達(dá)VEGFA，提示造干血細(xì)胞產(chǎn)生的VEGFA對(duì)肝干細(xì)胞亦具有調(diào)節(jié)作用。第4、5w時(shí)，靠近原始肝的橫隔間充質(zhì)中的血管內(nèi)皮細(xì)胞中亦有VEGFA的表達(dá)，提示此時(shí)VEGFA可介導(dǎo)橫隔間充質(zhì)組織中的血管內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)肝干細(xì)胞增殖、分化的誘導(dǎo)作用。第4～6W，少數(shù)肝細(xì)胞呈VEGFA免疫反應(yīng)陽(yáng)性，表明此時(shí)VEGFA亦可通過(guò)自分泌途徑發(fā)揮作

15、用。本文首次注意到VEGFA及其受體flt1和flk1在人胚胎肝干細(xì)胞中的表達(dá)，提出VEGFA可能介導(dǎo)橫隔間充質(zhì)細(xì)胞、心肌細(xì)胞、造血細(xì)胞、肝外血管內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)肝干細(xì)胞增殖、分化的作用。 第4～12W，多數(shù)肝細(xì)胞中均有VEGFC強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)。第3～7W的心肌細(xì)胞與橫隔間充質(zhì)細(xì)胞中可見(jiàn)VEGFC免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞。第4、5w時(shí)，靠近原始肝的橫隔間充質(zhì)中的血管內(nèi)皮細(xì)胞中亦有VEGFC的表達(dá)。而肝干細(xì)胞中有其受體flt4免疫反應(yīng)。說(shuō)明心肌細(xì)胞

16、、橫隔間充質(zhì)細(xì)胞和肝外的血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的VEGFC可通過(guò)旁分泌途徑調(diào)節(jié)肝干細(xì)胞的增殖、分化，肝干細(xì)胞所產(chǎn)生的VEGFC通過(guò)自分泌途徑自我調(diào)節(jié)其發(fā)育。 總之，肝干細(xì)胞的增殖、分化過(guò)程受內(nèi)皮細(xì)胞、造血細(xì)胞、原始心肌和橫隔間充質(zhì)細(xì)胞等的調(diào)節(jié)，HGF、IGF-I、TGFβ1、VEGFA、VEGFC等因子可通過(guò)旁分泌和/或自分泌途徑調(diào)節(jié)胚胎肝干細(xì)胞的增殖、分化。 2.3HNF4αmRNA在小鼠肝發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)RT-PCR結(jié)果顯

17、示HNF4α在肝中的表達(dá)始于胚胎發(fā)育的第9d，并持續(xù)到新生，至成年時(shí)表達(dá)減弱。原位雜交顯示，肝索的多數(shù)細(xì)胞均呈HNF4α陽(yáng)性反應(yīng)，成年時(shí)仍有少數(shù)呈HNF4α陽(yáng)性的肝細(xì)胞，而膽管板及膽管上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、造血細(xì)胞等均為陰性。說(shuō)明在胚胎發(fā)育過(guò)程中HNF4αmRNA表達(dá)與肝芽的形成有關(guān)，并參與肝干細(xì)胞向肝細(xì)胞的增殖、分化的過(guò)程，其在正常成年肝中表達(dá)可能與肝細(xì)胞分化狀態(tài)的維持有關(guān)。 2.4HNF6mRNA在小鼠肝發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)H