誘導小鼠胚胎干細胞分化為腸上皮干細胞及其純化的研究.pdf

1、胚胎干細胞(embryonicstemcell，ESC)是一種具有強大的多向分化潛能及自我更新能力的多能干細胞，其來源于受精卵細胞分化后的早期囊胚內細胞團，在體內或體外可以分化為成體幾乎所有類型的組織細胞，為研究胚胎發(fā)育、細胞定向誘導分化、組織器官工程、干細胞移植治療等多個學科領域提供了理想的研究對象及細胞來源。應用ESC或其分化后細胞進行移植治療成體器官的結構損傷及功能不全是近年來ESC研究及應用的主要進展之一，這一技術將可能成為未來

2、臨床上治療某些不可逆性疾病的新選擇。 小腸上皮組織主要由吸收細胞、杯狀細胞、神經內分泌細胞及潘式細胞構成。這4種細胞均由位于腸隱窩底部的腸上皮干細胞(intestinalepithelialstemcell，IESC)分化而來，它們所組成的腸絨毛和隱窩結構是小腸施行吸收、分泌等生理功能的重要結構基礎。正常情況下，IESC自身的增殖與分化維持一定的動態(tài)平衡。然而臨床上某些疾病嚴重干擾了這種快速的自身修復機制，導致腸上皮形成難治性損

3、傷，甚至累及至隱窩底部的IESC，使損傷不能修復，極大影響著患者的生活質量，是當今臨床治療上一個棘手的問題。 針對腸黏膜損傷的傳統(tǒng)治療方法，如：小腸移植治療、全胃腸外營養(yǎng)及外源性補充細胞因子促進上皮再生等均存在一定的不足。近年來，一些學者開始探討移植具有腸上皮修復潛能的細胞治療難治性小腸損傷，其成果日益受到國內外學者的廣泛關注。然而，IESC作為理想的小腸上皮修復細胞由于其來源受限，一直難以進行相關的實驗研究。因此，尋求并建立一

4、種新的用于移植修復小腸上皮損傷的IESC來源在推動細胞移植治療腸道損傷方面具有重要意義。 本次研究利用小鼠ESC所具有的三個胚層分化潛能及表皮細胞生長因子(epidermalgrowthfactor，EGF)在腸上皮細胞和IESC分化中的重要作用，在體外使ESC形成胚體(embryonicbody，EB)，確定其中IESC和腸上皮細胞的前體細胞群一定型內胚層的分化時間點，并以此階段的EB細胞作為前體采用EGF進行IESC的體外誘

5、導分化，期望利用這一分階段誘導方法確立體外誘導小鼠E14TG2a系ESC定向分化為IESC的條件，并評價其體內分化及修復放射性小腸損傷的能力，同時探索利用微球囊培養(yǎng)法、側群細胞分選及構建IESC標志基因啟動子報告基因載體等方法體外純化IESC的可行性，為IESC體外誘導分化、分離及建立新的移植修復細胞來源提供實驗基礎。 研究目的： 本研究以小鼠ESC的多向分化潛能為基礎，探討體外分階段誘導ESC分化為IESC的可行性及條

6、件，為細胞移植治療小腸上皮損傷及小腸組織器官工程提供細胞來源；在獲得含有IESC的細胞群后，探討通過側群細胞分選、構建IESC標志基因啟動子報告基因載體及微球囊培養(yǎng)法體外富集IESC的可行性，為體外純化IESC積累實驗經驗。 研究內容及方法： 1.以小鼠E14TG2a系ESC作為研究對象，在體外進行擴增培養(yǎng)，采用1000u/ml的白血病抑制因子(leukaemiainhibitiryfactor，LIF)抑制其分化；并使

7、用染色體G顯帶技術明確E14TG2a系ESC的染色體核型，為后續(xù)體內實驗設計提供依據(jù)；采用懸滴培養(yǎng)法培養(yǎng)EB，使其進入三個胚層的分化階段。 2.以CXCR4、E—cadherin(ECD)、Glypican1(Gpc1)、Transmembrane4superfamily2(Tm4sf2)、goosecoid(Gsc)作為定型內胚層的標志分子，采用流式細胞儀及逆轉錄聚合酶鏈反應(reverse—transcriptionpoly

8、merasechainreaction，RT—PCR)監(jiān)測EB形成過程中定型內胚層的分化情況，并與臟內胚層分化鑒別；同時探討懸滴培養(yǎng)下含50ng/mlActivinA的無血清培養(yǎng)基在提高定型內胚層分化比例中的作用。 3.確定定型內胚層分化的時間點后，在體外采用含40ng/mlEGF的無血清培養(yǎng)基誘導推測的IESC(putativeIESC，PIESC)分化，并以Musashi1(Msi1)及hairyandenhancerofs

9、plit1(Hes1)作為IESC的標志分子，采用實時定量PCR、Westernblots及免疫細胞化學監(jiān)測及鑒定PIESC分化。 4.種植PIESC及對照細胞至NOD/SCID小鼠皮下，培育移植瘤，通過組織學和小腸上皮細胞標志分子的免疫組化及RT—PCR分析等方法觀察PIESC在NOD/SCID小鼠體內的分化情況，并與對照組比較，評價其小腸上皮的分化能力。 5.利用16Gy的β射線一次性全腹部照射雌性BALB/c小鼠，

10、制作急性放射性小腸損傷模型；通過設立照射及治療(RT組)、照射不治療(RNT組)、不照射但治療(NRT組)及不照射不治療(NRNT組)等組別評價照射后早期移植PIESC在修復小腸損傷和提高小腸修復質量中的作用，并利用性別交叉移植的方法，觀察雄性PIESC來源的供體細胞在受體小腸、肝、腎中的定植情況。 6.PIESC及其對照分化細胞在Hoechst33342染色后進行側群細胞的測定及分選，使用實時定量PCR及Westernblot

11、s測定IESC標志分子Msi1和Hes1在側群及非側群細胞中的表達，探討側群細胞分選在富集PIESC中的作用。 7.克隆猜測的Msi1啟動子序列，并構建Msi1啟動子報告基因載體pMsil—GFP，通過脂質體轉染PIESC，分離GFP陽性細胞，利用實時定量PCR及Westernblots測定Msi1和Hes1在GFP+及GFP—組分中的表達，探討構建pMsil—GFP在分離Msi1+Hes1+細胞(IESC)中的作用。

12、8.使用含40ng/mlEGF的DMEM/F12培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)PIESC，使其中部分細胞形成微球囊，利用離心法分離微球囊及其余的單個細胞，使用實時定量PCR測定兩者中Msi1及Hes1的表達，評價利用這一方法富集Msi1+Hes1+細胞(IESC)的可行性。 實驗結果： 1.小鼠E14TG2a系ESCs在添加1000u/mlLIF的基礎上，可以在體外擴增，形成典型的ESC克隆。此株ESC的染色體核型正常，為(40，XY)

13、，即雄性細胞。采用懸滴培養(yǎng)法，1×106/ml細胞密度的ESC可以形成1～1.5mm直徑的EB，進入分化狀態(tài)。 2.RT—PCR的分析結果顯示，定型內胚層標志基因Gsc、Tm4sf2及Gpc1在5天EB中的表達相對輝度分別為0.9809±0.0083、0.9231±0.0097及0.8639±0.0075，顯著高于其它階段的EB(P<0.05)。流式細胞儀測定CXCR4+細胞、ECD+細胞及CXCR4+ECD+細胞在第5天EB中

14、的比例分別為34.4±2.87％、29.0±3.21％及6.3±0.18％，顯著高于其它階段的EB(P<0.05)。采用含50ng/mlActivinA因子的無血清培養(yǎng)基可以使第5天EB中的CXCR4+細胞比例升高到41.9±3.21％，顯著高于對照組(P<0.05)。 結論： 1.采用懸滴培養(yǎng)法，在去除LIF的培養(yǎng)基中ESC可以形成EB，進入分化狀態(tài)。 2.懸滴培養(yǎng)5天的EB含有較多的定型內胚層細胞，是進行后續(xù)

15、PIESC定向誘導分化的理想前體細胞群。 3.SF—ActivinA(50ng/ml)培養(yǎng)基可以使懸滴培養(yǎng)5天的EB中所含定型內胚層的比例進一步升高。 4.通過5天的SF—EGF(40ng/ml)誘導，5天EB細胞群可以在體外分化為高度同步表達Msi1及Hes1的PIESC，其中部分克隆中心部位的細胞同時表達Msi1及Hes1，具有IESC的特征。 5.無血清的SF—EGF培養(yǎng)基不能長期維持PIESC中Msi1及

16、Hes1的高表達。 6.PIESC來源的移植瘤中大多為腺體樣結構及未定形細胞，這些組織或細胞表達小腸各種上皮細胞的標志分子，證明PIESC具有高度特異的小腸上皮細胞體內分化能力。 7.全腹一次性照射16Gy的β射線可以引發(fā)小鼠的急性放射性腸炎。 8.PIESC移植入放射性小腸損傷小鼠體內以后，可以特異的定植于損傷的小腸上皮，并且直接參與小腸上皮的重建，改善上皮組織的修復質量，在損傷小腸的功能及結構恢復中發(fā)揮重要作

17、用。 9.PIESC中存在側群細胞，且更高表達Msi1及Hes1，利用流式細胞儀分選側群細胞可以在一定程度上起到純化Msi1+Hes1+細胞的作用。 10.小鼠Msi1基因起始密碼子上游1208bp的序列中含有Msi1特異的啟動子序列。 11.構建pMsi1-GFP質粒載體瞬時轉染PIESC后可以利用GFP的表達標記Msi1+細胞，在此基礎上利用流式細胞儀分選可以獲得較為純化的Msi1+Hes1+細胞。