人胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為角膜內(nèi)皮樣細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、角膜病患病率高、致盲性強(qiáng)，位居全球致盲原因第二位，目前，全球約有超過(guò)1000萬(wàn)的角膜盲患者;同時(shí)，角膜病也是我國(guó)第二大致盲性眼病，調(diào)查顯示，我國(guó)現(xiàn)有角膜盲患者約100多萬(wàn)。迄今為止，同種異體角膜移植是治療不可逆性角膜盲最有效的方法。然而，角膜供體的極度匱乏使其應(yīng)用受到了限制，遠(yuǎn)遠(yuǎn)滿(mǎn)足不了角膜盲患者的需求;我國(guó)每年約有30萬(wàn)患者需行角膜移植術(shù)，但因供體角膜有限，每年施行移植手術(shù)的患者尚不足4000例(1.3％)。因此，尋找有效的角膜替代物

2、用于角膜移植一直是眼科界研究的熱點(diǎn)。目前人工角膜(Keratoprosthesis)是唯一被批準(zhǔn)用于臨床的角膜替代物，但其生物相容性差、術(shù)后并發(fā)癥多，限制了其在臨床的廣泛應(yīng)用。
　　組織工程角膜是近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。其材料來(lái)源豐富、生物相容性好，可最大程度的模擬天然角膜結(jié)構(gòu)和功能，有望替代天然角膜用于角膜移植，緩解角膜供體極其匱乏的壓力。因此，組織工程角膜的研究具有重大社會(huì)意義及顯著經(jīng)濟(jì)效益。組織工程角膜是通過(guò)將種子細(xì)胞（角膜上皮細(xì)

3、胞、基質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞）接種子支架材料，經(jīng)過(guò)體外三維培養(yǎng)構(gòu)建而成。種子細(xì)胞和支架材料是組織工程角膜構(gòu)建的兩大關(guān)鍵要素。我們課題組前期研制的脫細(xì)胞豬角膜基質(zhì)(acellular porcine corneal matrix，APCM)，其中的異種細(xì)胞及遺傳物質(zhì)被完全脫除，同時(shí)膠原及其天然排列結(jié)構(gòu)得到了保留，從而具有良好的透光性、生物相容性以及機(jī)械力學(xué)性能;組織工程角膜前、后板層的成功構(gòu)建充分證實(shí)APCM是組織工程角膜構(gòu)建的良好支架材料。種

4、子細(xì)胞必須具備較強(qiáng)的增殖能力，能在體外大量擴(kuò)增。人角膜基質(zhì)細(xì)胞在體外有較強(qiáng)的增殖能力，而上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞增殖能力有限，尤其是內(nèi)皮細(xì)胞，幾乎沒(méi)有增殖能力，難以在體外培養(yǎng)、擴(kuò)增，因此尋找新的內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)源成為亟待解決的問(wèn)題。目前由于尚未找到理想的內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)源，大部分有關(guān)組織工程角膜構(gòu)建的研究都是利用增殖能力相對(duì)較強(qiáng)的低等動(dòng)物的角膜內(nèi)皮細(xì)胞或永生化人角膜內(nèi)皮細(xì)胞系等作為內(nèi)皮細(xì)胞的種子細(xì)胞，此類(lèi)內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)建的組織工程角膜可用于體外實(shí)驗(yàn)研究，但是

5、難以滿(mǎn)足臨床應(yīng)用的要求。
　　胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells，ESCs)因其所具有的強(qiáng)大增殖能力和分化全能性可作為一種良好的種子細(xì)胞來(lái)源，為組織工程器官構(gòu)建提供無(wú)限的細(xì)胞供給。目前已有人胚胎干細(xì)胞(human embryonic stem cells，hESCs)誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、多巴胺神經(jīng)元及運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元等體細(xì)胞的報(bào)道。然而，迄今為止，國(guó)內(nèi)外尚無(wú)hESCs誘導(dǎo)分化成角膜內(nèi)皮細(xì)胞的研究報(bào)道。因此如

6、能實(shí)現(xiàn)hESCs向角膜內(nèi)皮細(xì)胞的誘導(dǎo)分化，這將為組織工程角膜的構(gòu)建提供理想的種子細(xì)胞來(lái)源。
　　因此，本研究探討了將hESCs定向誘導(dǎo)分化為角膜內(nèi)皮樣細(xì)胞(corneal endothelial cell-like cells，CEC-like cells)的可行性，獲得了在形態(tài)和功能上接近正常角膜內(nèi)皮細(xì)胞的CEC-like cells;將CEC-like cells接種于后板層脫細(xì)胞豬角膜支架(posterior acellul

7、ar porcine corneal matrix，PAPCM)后彈力層表面構(gòu)建組織工程角膜內(nèi)皮植片，體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)構(gòu)建物具有天然角膜后板層的形態(tài)和功能。
　　[目的]角膜脫水狀態(tài)和透明性的維持很大程度上依賴(lài)于角膜內(nèi)皮細(xì)胞的屏障及泵功能。人角膜內(nèi)皮細(xì)胞在體內(nèi)沒(méi)有增殖能力，體外培養(yǎng)條件下增殖能力也極其有限。因此，獲取大量具有正常角膜內(nèi)皮細(xì)胞功能的細(xì)胞有利于角膜內(nèi)皮細(xì)胞基礎(chǔ)研究和角膜內(nèi)皮功能失代償?shù)闹委?。本研究探討體外誘導(dǎo)人胚胎干

8、細(xì)胞經(jīng)眼周間充質(zhì)干細(xì)胞分化為角膜內(nèi)皮樣細(xì)胞的可行性。
　　[方法]通過(guò)Transwell共培養(yǎng)體系，將人胚胎干細(xì)胞與正在向成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化的人角膜基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)5天，分化為眼周間充質(zhì)干細(xì)胞;改為人晶狀體上皮細(xì)胞源性條件培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)已向眼周間充質(zhì)干細(xì)胞分化的人胚胎干細(xì)胞14天，使其進(jìn)一步分化為角膜內(nèi)皮樣細(xì)胞。利用免疫熒光法檢測(cè)誘導(dǎo)細(xì)胞眼周間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記物CD73和FOXC1以及角膜內(nèi)皮細(xì)胞分化標(biāo)記物N型鈣粘素、FOXC1、PITX

9、2、Na+/K+ATP酶和閉鎖小帶蛋白-1(zonula occluden-1，ZO-1)的表達(dá)。流式細(xì)胞儀分選CD73表達(dá)陽(yáng)性的眼周間充質(zhì)干細(xì)胞;N型鈣粘素/Vimentin雙陽(yáng)性的角膜內(nèi)皮樣細(xì)胞。為進(jìn)一步證明人胚胎干細(xì)胞向角膜內(nèi)皮細(xì)胞分化，對(duì)分選出的眼周間充質(zhì)干細(xì)胞和角膜內(nèi)皮樣細(xì)胞行免疫印跡（Western blotting）和實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real time-polymerase chain reaction，RT-PC

10、R)檢測(cè)，評(píng)估Na+/K+ATP酶在這兩種細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況。分選出的角膜內(nèi)皮樣細(xì)胞在體外傳代培養(yǎng)，擴(kuò)增后，行免疫熒光檢測(cè)Na+/K+ATP酶、ZO-1、N型鈣粘素及Vimentin表達(dá)情況;擴(kuò)增的角膜內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)羧基熒光素琥珀酰亞胺酯(Carboxyfluorescein Diacetate Sueeinimidyl Ester,CFDASE)標(biāo)記后，接種于脫細(xì)胞豬角膜基質(zhì)后板層構(gòu)建角膜內(nèi)皮植片。角膜內(nèi)皮植片泵功能通過(guò)體外尤氏灌流系統(tǒng)及體

11、內(nèi)動(dòng)物移植實(shí)驗(yàn)進(jìn)行評(píng)估。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物術(shù)后觀察2月，定期行裂隙燈顯微鏡檢查照相、角膜內(nèi)皮鏡、激光共聚焦顯微鏡及取材病理切片HE染色等檢查。
　　[結(jié)果]人胚胎干細(xì)胞與分化的人角膜基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)5天，可見(jiàn)大量梭形細(xì)胞從貼壁的擬胚體爬出，表達(dá)眼周間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記物CD73和FOXC1;更換為人晶狀體上皮細(xì)胞源性條件培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)7天，可見(jiàn)眼周間充質(zhì)干細(xì)胞由梭形逐漸變?yōu)槎噙呅?，表達(dá)人角膜內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物N型鈣粘素、FOXC1、PITX2、Na+

12、/K+ATP酶和ZO-1。流式細(xì)胞儀成功分選出CD73表達(dá)陽(yáng)性的眼周間充質(zhì)干細(xì)胞及N型鈣粘素/Vimentin雙陽(yáng)性的角膜內(nèi)皮樣細(xì)胞。Western blotting和實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real time-polymerase chain reaction，RT-PCR)檢測(cè)表明角膜內(nèi)皮樣細(xì)胞較眼周間充質(zhì)干細(xì)胞Na+/K+ATP酶表達(dá)明顯上調(diào)。角膜內(nèi)皮樣細(xì)胞在體外傳代培養(yǎng)2代，擴(kuò)增后的細(xì)胞Na+/K+ATP酶、ZO-1、N型鈣粘素

13、及Vimentin表達(dá)陽(yáng)性。擴(kuò)增的角膜內(nèi)皮樣細(xì)胞經(jīng)CFDASE標(biāo)記后，熒光顯微鏡下見(jiàn)綠色熒光，接種于脫細(xì)胞角膜基質(zhì)后板層成功構(gòu)建角膜內(nèi)皮植片。構(gòu)建物具有正常人角膜后板層類(lèi)似的形態(tài)結(jié)構(gòu);尤氏灌流系統(tǒng)檢測(cè)內(nèi)皮泵功能參數(shù)，角膜內(nèi)皮植片與正常人角膜泵功能參數(shù)接近;將構(gòu)建的角膜內(nèi)皮植片移植到角膜內(nèi)皮功能失代償兔動(dòng)物模型眼內(nèi)（實(shí)驗(yàn)組），角膜逐漸恢復(fù)透明，而單純移植脫細(xì)胞角膜基質(zhì)后板層的兔眼角膜水腫混濁持續(xù)加重（對(duì)照組）。角膜內(nèi)皮鏡檢查見(jiàn)實(shí)驗(yàn)組角膜后