葛根素促進(jìn)小鼠胚胎干細(xì)胞源工作心肌細(xì)胞的分化及其調(diào)控機(jī)制.pdf

1、本文對葛根素促進(jìn)小鼠胚胎干細(xì)胞源工作心肌細(xì)胞的分化及其調(diào)控機(jī)制進(jìn)行了研究。本研究分為兩個(gè)部分：
　　 第一部分：
　　 目的：干細(xì)胞源心肌細(xì)胞是再生醫(yī)學(xué)中治療心力衰竭等心臟疾病的很有前景的細(xì)胞來源。如何進(jìn)一步提高干細(xì)胞源心肌細(xì)胞的分化率以確保充足的細(xì)胞來源是目前急需解決的首要問題。傳統(tǒng)中藥的活性成分葛根素已經(jīng)廣泛運(yùn)用于臨床治療各種心血管疾病。本課題旨在研究葛根素對離體培養(yǎng)的小鼠胚胎干細(xì)胞（murine embryonic

2、 stemcells，mES細(xì)胞）向心肌細(xì)胞分化的作用及其調(diào)控機(jī)制。
　　 方法：首先采用MTT 法檢測不同濃度的葛根素對mES細(xì)胞增殖能力的影響，篩選適合用于誘導(dǎo)分化的葛根素濃度。采用經(jīng)典誘導(dǎo)心肌分化的三步法，即“懸滴-懸浮-貼壁”，持續(xù)用1μmol/L、10μmol/L、100μmol/L 葛根素誘導(dǎo)mES細(xì)胞分化。倒置顯微鏡下連續(xù)觀測胚體（embryoid body，EB）大小和跳動(dòng)EB（含跳動(dòng)區(qū)域的EB）的比例。運(yùn)用免疫

3、熒光染色法檢測心肌特異性蛋白a-肌小節(jié)輔肌動(dòng)蛋白（a-sarcomeric-actinin）的表達(dá)。運(yùn)用反轉(zhuǎn)錄PCR檢測不同胚層標(biāo)志物的表達(dá)。用western blot 檢測葛根素誘導(dǎo)分化后絲氨酸-蘇氨酸激酶(serine-threonine kinase,Akt)和磷酸化絲氨酸-蘇氨酸激酶(phosphorylation of the serine-threonine kinase,P-Akt)的表達(dá)。
　　 結(jié)果：葛根素促進(jìn)

4、mES細(xì)胞增殖，增加分化過程中跳動(dòng)EB 比例。100μmol/L 葛根素為最佳實(shí)驗(yàn)濃度。免疫熒光結(jié)果顯示葛根素明顯增多分化第12天a-sarcomericactinin陽性細(xì)胞。半定量RT-PCR分析表明葛根素明顯上調(diào)分化早期內(nèi)胚層、中胚層標(biāo)志性基因表達(dá)，但顯著下調(diào)外胚層標(biāo)志性基因。葛根素組EB的直徑顯著增大，P-Akt的表達(dá)上調(diào)。
　　 結(jié)論：葛根素促進(jìn)mES細(xì)胞增殖，影響mES細(xì)胞分化方向。其作用可能與磷脂酰肌醇(-3)激酶

5、/絲氨酸-蘇氨酸激酶(phosphatidylinositol 3-kinase /serine-threonine kinase，PI3K/Akt)途徑有關(guān)。
　　 第二部分：
　　 目的：多能干細(xì)胞分化出的心肌樣細(xì)胞包括起搏樣心肌細(xì)胞，心房樣心肌細(xì)胞，心室樣心肌細(xì)胞。心肌梗死部位好發(fā)于心室，用心室樣心肌細(xì)胞修復(fù)心肌梗死部位明顯更具優(yōu)勢。干細(xì)胞來源的心肌細(xì)胞含有多種類型，如何在提高心肌分化率的同時(shí)，促進(jìn)心室樣心肌細(xì)胞的

6、特化的研究仍然甚少。已有關(guān)于植物雌激素能夠調(diào)節(jié)心肌發(fā)育調(diào)控基因生長因子(B)(TGF-(B))、骨形成蛋白(BMP)和Wnt的報(bào)道，而且第一部分的研究也顯示植物雌激素葛根素能促進(jìn)鼠胚胎干細(xì)胞（mES cells）向心肌分化，所以此部分的課題主要研究葛根素對mES細(xì)胞向心肌分化的影響，檢測向心室樣心肌細(xì)胞分化的效率和機(jī)制。
　　 方法：采用經(jīng)典的“懸滴-懸浮-貼壁”三步法，持續(xù)用100μmol/L 葛根素誘導(dǎo)mESCs分化。用流式

7、細(xì)胞術(shù)檢測心肌肌小節(jié)特異性a-肌小節(jié)輔肌動(dòng)蛋白（a-sarcomeric-actinin）陽性細(xì)胞的含量。RT-PCR檢測心肌特異性標(biāo)志物和心肌發(fā)育調(diào)控基因。采用膜片鉗技術(shù)分別測定起搏樣細(xì)胞，心房樣心肌細(xì)胞和心室樣心肌細(xì)胞的含量。
　　 結(jié)果：葛根素能提高跳動(dòng)胚體的百分比，能提高a-sarcomeric actinin 陽性細(xì)胞的百分比。在分化早期葛根素處理組T-box5（Tbx5），心肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2c（myocyteenha

8、ncer factor 2c，MEF2c)和心肌肌球蛋白重鏈（a-myosin heavy chain，a-MHC)的表達(dá)較陰性對照組明顯提高。在進(jìn)一步的分化過程中葛根素能提高心室肌特異性基因MLC2的表達(dá)，同時(shí)降低起搏樣細(xì)胞的特異性基因HCN4的表達(dá)。膜片鉗結(jié)果也顯示葛根素誘導(dǎo)mES細(xì)胞分化出的心室樣心肌細(xì)胞含量較陰性對照組高。在分化早期葛根素能明顯上調(diào)TGF-(B)1，2，3,和 Wnt11的表達(dá)，而對Wnt3a，BMP 2和BMP