TNNI3K基因過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)小鼠胚胎干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化及機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　TNNI3K是一種具有絲裂酶原蛋白激酶活性的心肌特異性激酶，因與cTnI相互作用而得名。近十幾年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，一方面，TNNI3K可能參與了心臟向心性肥厚、PR間期延長(zhǎng)及加速擴(kuò)張性心肌病的進(jìn)展等病理過(guò)程;另一方面，TNNI3K在減少缺血性心室重構(gòu)，增強(qiáng)心肌功能，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞分化以及增加心肌細(xì)胞數(shù)量等方面發(fā)揮心臟保護(hù)作用。染色體定位分析提示TNNI3K基因位于1號(hào)染色體短臂3區(qū)1帶(1p31.1-p31.2)。該區(qū)域恰與心

2、臟房室間隔缺損易患基因所在區(qū)域鄰近。我們推測(cè)TNNI3K可能參與了心臟發(fā)育過(guò)程的某個(gè)階段及心肌細(xì)胞分化過(guò)程。因此，本研究旨在探討TNNI3K在小鼠胚胎干細(xì)胞(mouse embryonic stem cell，mESC)向心肌細(xì)胞分化過(guò)程中的作用及相關(guān)分子機(jī)制，以期闡明TNNI3K與心肌細(xì)胞分化的關(guān)系。
　　方法:
　　首先，通過(guò)檢測(cè)干細(xì)胞全能性表面標(biāo)志物SSEA-1和Oct-4、堿性磷酸酯酶陽(yáng)性試驗(yàn)以及H.E染色實(shí)驗(yàn)鑒定m

3、ESC的全能性。繼而，采用傳統(tǒng)的懸滴法培養(yǎng)mESC形成EB，除去LIF使其自分化為跳動(dòng)的心肌細(xì)胞，通過(guò)real-time PCR檢測(cè)心肌細(xì)胞相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量，western blotting檢測(cè)心肌細(xì)胞特異性標(biāo)志物蛋白相對(duì)表達(dá)量，細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)心肌細(xì)胞特異蛋白的定位表達(dá)，以及TEM觀察心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)特異標(biāo)志物肌纖維等方法鑒定所分化的心肌細(xì)胞。進(jìn)一步，采用慢病毒分別攜帶hTNNI3K基因和siRNA永久性轉(zhuǎn)染mESC并分別分化為心

4、肌細(xì)胞，通過(guò)real-time PCR檢測(cè)各組心肌細(xì)胞特異性基因的相對(duì)表達(dá)量，western blotting檢測(cè)心肌細(xì)胞特異性標(biāo)志物蛋白的相對(duì)表達(dá)量，細(xì)胞免疫熒光共定位檢測(cè)心肌細(xì)胞特異性蛋白時(shí)空相對(duì)表達(dá)，F(xiàn)CM分選cTnT+細(xì)胞率等判斷hTNNI3K對(duì)心肌細(xì)胞分化的影響。此外，我們選取了Connexin40、Connexin45和Ctnt分別作為檢測(cè)了心房肌細(xì)胞、竇房結(jié)細(xì)胞和心室肌細(xì)胞表面標(biāo)志物基因的相對(duì)表達(dá)量。最后，我們對(duì)hTNNI

5、3K組、shRNA組以及各自對(duì)照組進(jìn)行western blotting檢測(cè)MAPK信號(hào)通路相關(guān)蛋白的相對(duì)表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　研究結(jié)果表明，mESC表面蛋白分子SSEA-1和Oct-4表達(dá)呈陽(yáng)性（綠色熒光），ALP高表達(dá)呈藍(lán)紫色，H.E染色核質(zhì)比＞＞1。正常自分化的心肌細(xì)胞相關(guān)基因和蛋白表達(dá)呈現(xiàn)時(shí)空特性;分化16d時(shí)細(xì)胞免疫熒光顯示MLC2、cTnI、cTnT以及α-actinin在胞漿高表達(dá)（綠色熒光），肌節(jié)清晰可見(jiàn)。T

6、EM顯示心肌細(xì)胞獨(dú)有的肌纖維亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)。hTNNI3K組心肌細(xì)胞相關(guān)基因高表達(dá)(P＜0.05)。Western blotting顯示心肌特異性蛋白MLC2、cTnT、cTnI、a-actinin等顯著高于其對(duì)照組(p＜0.05)，且細(xì)胞免疫熒光雙染結(jié)果顯示MHC6蛋白提前表達(dá)。FCM結(jié)果顯示cTnT+陽(yáng)性細(xì)胞率顯著高于對(duì)照組(p＜0.05)。干擾shRNA組不僅cTnT+陽(yáng)性細(xì)胞率顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)，而且心肌特異蛋白也顯著低

7、于對(duì)照組(p＜0.05)，MHC6蛋白表達(dá)延后。通過(guò)檢測(cè)Connexin4、Connexin40和Ctnt相對(duì)表達(dá)量，我們發(fā)現(xiàn)，這三個(gè)基因表達(dá)量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。通過(guò)檢測(cè)MAPK信號(hào)通路相關(guān)蛋白發(fā)現(xiàn)，hTNNI3K組P-p38、P-ERK和P-JNK均被抑制，且P-P38和P-JNK蛋白抑制更明顯，而Flag-only組、shRNA組和non-sense RNA組信號(hào)通路蛋白均正常表達(dá)。
　　結(jié)論:
　　TNNI