人胚胎生殖細胞向心肌細胞誘導(dǎo)分化及質(zhì)譜分析研究.pdf

1、目的:1.建立以人胚胎成纖維細胞為飼養(yǎng)層體外培養(yǎng)、擴增人胚胎生殖細胞(human embryonic germ cells,hEGCs,人EG細胞)的方法。2.利用抗壞血酸誘導(dǎo)人胚胎生殖細胞向心肌細胞分化；3.探討人胚胎生殖細胞向心肌細胞分化過程中蛋白質(zhì)表達譜的改變。
　　 方法:取5-10周人胚胎生殖腺嵴,組織塊培養(yǎng)法原代培養(yǎng)人EG細胞；取同一胚胎來源的人胚胎成纖維細胞作飼養(yǎng)層,傳代培養(yǎng)人EG細胞。將生長良好的人EG細胞,接種

2、于細菌培養(yǎng)皿中進行懸浮培養(yǎng),7天后將形成的擬胚體置于明膠包被的24孔培養(yǎng)板中,加入含0.1mg／ml抗壞血酸的誘導(dǎo)液進行誘導(dǎo)分化培養(yǎng),用免疫熒光法檢測誘導(dǎo)2周后細胞中心肌肌鈣蛋白T(cTnT)的表達。分別提取人EG細胞和誘導(dǎo)2周后細胞的蛋白質(zhì),采用iTRAQ試劑對蛋白樣品進行差異標記(114標記誘導(dǎo)細胞蛋白組、115標記人EG細胞蛋白組)、液相色譜(LC)分離這2組樣品的總蛋白、串聯(lián)質(zhì)譜(MS／MS)鑒定人EG細胞和誘導(dǎo)后細胞差異表達的

3、蛋白。
　　 結(jié)果:體外培養(yǎng)的人胚胎成纖維細胞呈長梭形,生長狀態(tài)良好。以同源人胚胎成纖維細胞為飼養(yǎng)層傳代培養(yǎng)的人EG細胞增殖旺盛,其集落呈典型的“鳥巢狀”,和原代培養(yǎng)形成的克隆大小無明顯區(qū)別,目前已傳到第6代。人EG細胞經(jīng)抗壞血酸誘導(dǎo)2周后,陽性表達cTnT,細胞呈多邊形。質(zhì)譜分析共鑒定出349種蛋白(蛋白置信度>95％),其中27種蛋白(21種上調(diào)蛋白、6種下調(diào)蛋白)在人EG細胞和誘導(dǎo)后細胞中差異顯著(差異倍數(shù)>3)。