人胚胎生殖細胞的分離培養(yǎng)與鑒定.pdf

1、、 人胚胎生殖細胞的分離培養(yǎng)與鑒定摘 要人胚 胎生 殖細 胞 ( e m b 砂 o n i c g e r m c e l l s ， E Gc e l l s ) 來源于原 始生 殖細 胞的 多能 性的千細胞，目 前， 小鼠 和人胚胎干細胞的 分離培養(yǎng)均取得了 一些重大的 進展， 但是有關人P G C s 發(fā)育分化、 體外分離培養(yǎng)體系及人 E G細胞檢測等方面還不是很完善，因 此對于來源于原始生殖細胞的 人胚胎生 殖細胞的 研究仍然

2、具有十分重要的意義。1 . 人胚胎原始生殖細胞的發(fā)生、 遷移及相關基因的 表達。采用 隊5 染色， 免疫組化 ( O C T 4 和h T E R T ) 染色和R l ’ - P C R( O C T 4 和h T E R T )檢測， 研究了6 ~1 9周人胚胎生殖靖的 組織結(jié)構以 及原始生殖細胞在遷移中的 形態(tài)學特征、 變化及基因 ( O C T 4 和h T E R T ) 的表達。 結(jié)果表明， 人胚胎從第6 周開 始， 生殖靖

3、中 有 O C T 4 的陽性細胞， 但是數(shù)量不多， 第 8 一1 2周， 生殖蠟中表達 O C T 4 的陽性細胞比 較多， 第 1 3周后， 生殖靖中表達的O C T 4 逐漸減少， 生殖靖中的P G C s 大部分分化;而在6 一巧周時， h T E R T 都有陽 性細胞的表達， 而且表達的陽 性細胞比 較廣泛。2 . 不同培養(yǎng)液對人原始生殖細胞原代培養(yǎng)的影響。比 較了7 種培 養(yǎng)液 ( 包括 細 胞條 件培 養(yǎng) 液) 分離培

4、養(yǎng)人P G C s ， 結(jié) 果 表明K S R 培養(yǎng)液 和S T O 條 件培 養(yǎng)液 適用于P G C s 的 原 代 培 養(yǎng); 用5 種含不同 質(zhì)量濃 度U F 的 培 養(yǎng)液 培 養(yǎng) 人P G C s ，結(jié) 果 顯 示 培 養(yǎng) 液中 添 加1 0 n g / 1 l l L l F 時 ， 原 代P G Cs 出 現(xiàn)的 平 均 集 落 數(shù) 最 多 ， 但 與 添 加5 和1 0 n 的I L L I F 相比 差 異 不 顯 著， 而

5、 與 添 加0 和I n 留 n 1 L L I F 相比 差 異 顯 著。3 .在成功分離培養(yǎng)人E G細胞后， 對人 E G細胞進行了鑒定。以D M E M + 巧 % K S R的 無 血清 培 養(yǎng)體 系 培養(yǎng)， 添 加細 胞因 子u F ( 1 0n 創(chuàng) 1 l l L ) + bF G F( 4 n g 加 L ) + F o r s k o l i n ( 1 0 卜 M ) ， M E F 作 飼 養(yǎng) 層 ， 成 功 分 離

6、 培 養(yǎng) 后 得 到 人E G 細 胞 。 實驗共用5 6 例5 一1 9周流產(chǎn)胎兒， 培養(yǎng)得到人E G細胞共 1 6株， 其中 1 株最高傳至 5 代。通過A K P 染色、 免疫組化染色和即飛 P C R 方法檢測， 人E G 細胞特異性表達A K P 、 O C T 4、S S E A 一 1 、S S E A 一 3 、S S E A 一 4 、 T R A 一 1 一 6 0 、 T R A 小8 1 、C 一 k i t ，

7、 和 h T E R T ，這些研究豐富了 人E G細胞生物學特性和檢測方法。關 鍵詞: 人; 原始生殖細胞; 胚胎生 殖細胞; 胚胎干細胞; O C T 4 ; h T ER T研究生學位論文的獨創(chuàng)性聲明長 人聲 明:聽呈交的學歷碩士學位淪文走我個人在導師指導下獨立進行 的研究工作及取1 等 約研究結(jié)果;論文中的研究畜 創(chuàng) 居 及結(jié)果是按學校 《 關于規(guī)范西北農(nóng) 林科技大 學研 究生學術道德的 暫行規(guī)定》獲 得的 ， 如果 違 反此規(guī)

8、定， 一切后果與法律 責任均由木人承 擔.盡我所知.除了 文中 特別加以標注和致種 知 勺 地方外， 論文中不包 含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的 研究結(jié)果. 也不包 含其他人和自己 本人已 獲得西北農(nóng) 沐科技大學 或共它 教育 機構的學位或證書而使用過的 材料.與我一同工 作的 同志對本研究所做的任何貢獻均已 在論文的致1 針 中 作了明確的說明并表示了附意研 究 生 簽 名 : 于 ; 叁 終 時 間 :夕 夠 年 了月川 日導師指導研究

9、生學位論文的承諾本 人 承 諾 : 我 的 學 歷 碩 士 研 究 生 ~ 三 魚斷呈 交 的 學 歷 碩 士 學 位 論 文 是 在 我指導下獨立開 展研究工作及取得的研兄結(jié)果， 屬于 我現(xiàn)崗 職務工作的結(jié)果，并嚴格按照學 校 《 關 于 規(guī)范西北農(nóng)林科技大學 研完 生學術道德的 暫行規(guī)定》 而獲得的研 究結(jié)果.如果 違反學校 《 關于 規(guī)范西北農(nóng)林 科技大學 研究生學術 近德的暫行規(guī)定》 ， 我必須接受按學校有關 規(guī)定的處罰處理并承

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