昆明白小鼠胚胎生殖細(xì)胞的分離與培養(yǎng).pdf

1、胚胎生殖細(xì)胞(Embryonic germ cells，EG cells)是繼胚胎癌細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞之后發(fā)現(xiàn)的又一多能性干細(xì)胞。本研究以昆明白小鼠胎兒生殖嵴為材料，從原始生殖細(xì)胞中分離出EG細(xì)胞，并進(jìn)行傳代培養(yǎng)和鑒定，對(duì)影響EG細(xì)胞分離與培養(yǎng)的因素進(jìn)行了探討，為進(jìn)一步建立昆明白小鼠EG細(xì)胞系奠定基礎(chǔ)。主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下： 1)試驗(yàn)比較了三種分離培養(yǎng)方法對(duì)獲得小鼠原代MEF的影響，發(fā)現(xiàn)酶消化法的分離效果好于組織塊法和酶結(jié)合組織塊法，

2、適合原代MEF的分離。制作成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層時(shí)，10μtg/mL絲裂霉素C處理90min可以有效抑制成纖維細(xì)胞的增殖，適合用于MEF飼養(yǎng)層的制作。 2)試驗(yàn)比較了采用不同胎齡胎兒分離培養(yǎng)EG細(xì)胞的效果，發(fā)現(xiàn)8.5dpc～10.5dpc胚胎初次分離所獲得的EG細(xì)胞集落較少，后期傳代能力也較差，難以有效建立EG細(xì)胞系；而11.5dpc～12.5dpc日齡胚胎初次分離獲得的類ES細(xì)胞集落較多，后期傳代能力較強(qiáng)，最高可傳至7代，有利于EG

3、細(xì)胞的長(zhǎng)期培養(yǎng)。 3)試驗(yàn)比較了“一次消化法”和“多次消化法”對(duì)EG細(xì)胞分離培養(yǎng)方面的影響，發(fā)現(xiàn)“多次消化法”可以得到較高的原代EG細(xì)胞克隆率，還能保持較高的細(xì)胞增殖能力，好于“一次消化法”，適宜于EG細(xì)胞的分離和傳代。 4)使用0.125％胰蛋白酶+0.02％EDTA的消化液進(jìn)行多次消化，原代EG細(xì)胞克隆率和平均傳代次數(shù)較高，可取得較好的分離效果，但與0.1％的膠原酶Ⅳ組和0.25％胰蛋白酶+0.04％EDTA組相比差

4、異不顯著，5)大鼠心肌細(xì)胞條件培養(yǎng)液在小鼠EG細(xì)胞分離培養(yǎng)過(guò)程中，EG細(xì)胞克隆形成率和最高傳代數(shù)均高于EG細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)液組;在EG細(xì)胞的傳代培養(yǎng)中,RH-CM組培養(yǎng)效果最好,最高傳至7代而不分化。 6)試驗(yàn)比較了三種傳代方法對(duì)小鼠胚胎生殖細(xì)胞細(xì)胞分離培養(yǎng)的影響，發(fā)現(xiàn)“連同飼養(yǎng)層消化法”簡(jiǎn)單易行，而且傳代效果較好，EG細(xì)胞克隆形成率和傳代數(shù)均好于“機(jī)械離散法”，同“酶消化法”相比差異不顯著，二者最高均傳至7代。 7)試驗(yàn)比