雞胚原始生殖細胞的分離與培養(yǎng).pdf

1、近年來,作為精子和卵子的祖細胞的原始生殖細胞(PGCs)已成為另一種可選擇的多能性干細胞.來源于PGCs的干細胞稱胚胎生殖細胞.迄今為止僅在小鼠上獲得PGCs來源的真正意義上的胚胎干細胞(ES cells)即具有參與生殖系傳遞能力的ES細胞.取孵化5.5~6.5天含PGCs的雞胚生殖腺及其周圍組織,經(jīng)0.25﹪胰酶+0.02﹪EDTA消化后,接種于24孔培養(yǎng)板內(nèi).加入新鮮的EG細胞培養(yǎng)液(含DMEM、胎牛血清、雞血清、β-巰基乙醇、L-

2、谷氨酰胺、HEPES、雞胚浸出液以及細胞因子等成分)培養(yǎng)24小時以后,PGCs開始部分貼附于共培養(yǎng)的生殖原基細胞上.培養(yǎng)3~4天的PGCs大多已轉變?yōu)橛?~20細胞構成的集落,其中包括從PGCs群集或細胞本身增殖所形成的兩種集落類型.培養(yǎng)至5~7天,類EG克隆數(shù)目明顯增加.類EG細胞克隆呈規(guī)則的集落狀生長,多層分布,且有明顯的花紋.克隆內(nèi)的細胞間并不緊密排列,因此不難看出克隆內(nèi)的單個細胞.這與經(jīng)典的小鼠胚胎生殖細胞的形態(tài)有所不同.研究中

3、分離得到的雞類EG細胞經(jīng)PAS染色后呈深紫紅色,而雞胚成纖維細胞并不著色.將消化分散的類EG細胞在無分化抑制因子的類EG培養(yǎng)基中重懸培養(yǎng),3~4天后,可見部分細胞團形成簡單的胚體.在飼養(yǎng)層上生長的類EG細胞集落,在去除抑制分化因子的條件下培養(yǎng),長時間不傳代,可見細胞生長緩慢,自發(fā)分化,首先表現(xiàn)為失去原有的形態(tài),進而與周圍細胞界限不清,集落外圍的細胞與飼養(yǎng)層連成一片.最后將傳至3代、4代的類EG細胞集落離散后制作嵌合體,得到了一只毛色嵌合