雞胚性腺原始生殖細(xì)胞分離培養(yǎng)的研究.pdf

1、本試驗以羅曼雞和壽光黑雞胚胎性腺為實驗材料，分別制作18-28期雞胚的石蠟組織切片和18-28期雞胚性腺細(xì)胞涂片，并進(jìn)行PAS、Hoechst33258染色，觀察和比較gPGCs在正常組織與消化分離后的形態(tài)結(jié)構(gòu)特征。同時對18-28期胚胎gPGCs進(jìn)行消化分離、純化及培養(yǎng)。在此基礎(chǔ)上，用純化的gPGCs在不同的培養(yǎng)體系中培養(yǎng)。本研究的目的旨在明確雞胚原始生殖細(xì)胞(gPGCs)在遷入生殖原基之后的形態(tài)學(xué)與分布特征，掌握有效的分離gPGCs

2、的方法，探索gPGCs體外培養(yǎng)的影響因素及有效地培養(yǎng)條件，為發(fā)展雞gPGCs的體外操作技術(shù)奠定基礎(chǔ)。試驗結(jié)果如下： Ⅰ.PGCs形態(tài)學(xué)研究組織切片觀察表明，gPGCs呈圓形或卵圓形，有偽足，直徑為10μm-15μm，胞核呈圓形或橢圓形，偏向細(xì)胞邊緣，大小為5μm-7.5μm。核內(nèi)緣有少量異染色質(zhì)，常染色質(zhì)均勻分布。細(xì)胞懸液涂片觀察表明，游離的gPGCs呈圓形或卵圓形，有偽足，周圍有明顯的光環(huán)；直徑為12.5μm-20μm，PAS

3、反應(yīng)呈陽性。Hoechst33258染色后可見其胞核呈腎形或橢圓形，偏向細(xì)胞的邊緣，大小為5μm-7.5μm×12.5μm。核內(nèi)緣有少量異染色質(zhì)，常染色質(zhì)均勻分布。另外，可見27期雞胚性腺中部分PGCs仍處于分裂狀態(tài)，其胞體為12.5μm×32.5μm，Hoechst33258染色后，可見核位于中央且均等分布于赤道面兩側(cè)，大小為7.5μm×12.5μm。 Ⅱ.PGCs分布特點組織切片觀察表明，gPGCs剛遷入性腺時，均等分布于兩

4、側(cè)。22-23期gPGCs開始由右側(cè)經(jīng)背腸系膜向左側(cè)遷移。27期時，靠近左側(cè)性腺的背腸系膜邊緣仍有部分PGCs，呈單個或成群分布。此時，左側(cè)性腺gPGCs數(shù)目明顯多于右側(cè)。且gPGCs大部分位于性腺的皮層。說明27期為gPGCs從右側(cè)性腺向左側(cè)遷移的最后時期。 Ⅲ.生殖原基中PGCs增長變化趨勢分離18-28期羅曼雞和壽光雞胚胎性腺PGCs，并計數(shù)作統(tǒng)計分析。發(fā)現(xiàn)：gPGCs在性腺中主要有兩個快速增長期：18-19期和23-27

5、期。28期時，每只羅曼雞胚胎gPGCs個數(shù)顯著高于壽光雞。這可能是導(dǎo)致羅曼雞產(chǎn)蛋率高于壽光雞的原因之一。 Ⅳ.PGCs的分離純化28期時，每只羅曼雞胚胎獲得gPGCs為1745.07±306.5，占1.98％。每枚壽光雞胚胎可獲得gPGCs1401.80±289，占1.61％。將酶解法分離后獲得的性腺混合細(xì)胞培養(yǎng)24h，重新懸浮后將部分貼壁的基質(zhì)細(xì)胞除去，每枚羅曼雞可獲PGCs512.5±104.2個，壽光雞胚胎個數(shù)為：432.

6、5±106.5。Ficoll分離后，每只羅曼雞和壽光雞胚分別可獲得435.5±120.5和356.7±103.5個PGCs，分別占2.07％和1.87％。 Ⅴ.PGCs的培養(yǎng)研究28期胚胎性腺消化分散后，將PGCs分別培養(yǎng)于由添加bFGF和未添加bFGF的基礎(chǔ)培養(yǎng)基和無飼養(yǎng)層和以雞胚成纖維細(xì)胞為飼養(yǎng)層組成的四個培養(yǎng)體系中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，添加bFGF，可顯著提高gPGCs的存活率，以CEF為飼養(yǎng)層并添加bFGF培養(yǎng)基可顯著提高存活率和