雞胚胎原始生殖細(xì)胞的體外培養(yǎng)及嵌合體雞的制備和分子鑒定.pdf

1、轉(zhuǎn)基因研究是近年來生命科學(xué)研究中熱門、發(fā)展快的領(lǐng)域之一。相對于哺乳動物受精卵，鳥類的受精卵大且含大量卵黃，操作比較困難。人們尋找了另外一種細(xì)胞——PGCs細(xì)胞(primordialgermcells，PGCs，原始生殖細(xì)胞)代替受精卵作為轉(zhuǎn)基因鳥類的載體。PGCs容易操作，在雌性中它最終發(fā)育為卵細(xì)胞，在雄性中最終發(fā)育為精子。PGCs在胚胎中的遷移途徑——通過血液循環(huán)后移植入性腺，使它能成為冷凍保種的目標(biāo)細(xì)胞，同時成為轉(zhuǎn)基因鳥類制備中的良

2、好載體。 本實驗用40-60μm的玻璃針從孵化51-53小時的雞胚卵黃靜脈中取血，經(jīng)Ficoll密度梯度離心純化血液中的PGCs細(xì)胞，通過形態(tài)和過碘酸-希夫試劑染色鑒別，其純度可達(dá)75％左右。同時分離孵化5天的雞胚性腺細(xì)胞為基質(zhì)細(xì)胞，在添加多種生長因子(胰島素樣生長因子IGF-1、堿性成纖維細(xì)胞生長因子b-FGF、白血病抑制因子LIF)的條件下培養(yǎng)PGCs細(xì)胞，探索其體外培養(yǎng)的最佳條件。 本研究以廣東石歧雜雞為提供PGC

3、s細(xì)胞的供體雞，以荷蘭H系雞為接受供體PGCs細(xì)胞的受體雞。通過顯微注射的方法，將凍存復(fù)蘇后的PGCs供體細(xì)胞，濃縮至400個左右/μl，取1-1.5μl注入孵化60-64小時的受體雞胚血液中。接受了供體PGCs細(xì)胞的受體雞胚繼續(xù)孵化。后提取受體雞胚基因組DNA進(jìn)行AFLP(amplifiedfragmentlengthpolymorphism，AFLP，擴(kuò)增片段長度多態(tài)性)分子鑒定，測定實驗后的雞是否為嵌合體雞及其嵌合率的指標(biāo)。結(jié)果顯