DAZL基因?qū)﹄u胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)為生殖細(xì)胞的功能研究.pdf

1、胚胎干細(xì)胞(ESC)具有多向分化潛能，其中向生殖細(xì)胞分化的能力使得其備受關(guān)注，對(duì)ESC進(jìn)行轉(zhuǎn)基因修飾可以使其分化為生殖細(xì)胞。DAZL基因在生殖細(xì)胞發(fā)育早期至配子產(chǎn)生的過程中持續(xù)表達(dá)，是調(diào)控生殖細(xì)胞發(fā)育與分化的關(guān)鍵基因，但其對(duì)生殖細(xì)胞發(fā)育的作用機(jī)制及其對(duì)其他與生殖相關(guān)的基因調(diào)控作用尚不明確。本研究成功克隆雞DAZL基因，通過體外暫態(tài)表達(dá)進(jìn)行亞細(xì)胞定位，建立雞胚胎干細(xì)胞無飼養(yǎng)層培養(yǎng)體系以導(dǎo)入外源DAZL基因，誘導(dǎo)cESC向生殖細(xì)胞分化，為研

2、究DAZL基因的調(diào)控機(jī)制和胚胎干細(xì)胞來源的生殖細(xì)胞進(jìn)行臨床治療的應(yīng)用提供參考。主要研究內(nèi)容如下:
　　1.雞DAZL基因的克隆、序列分析及生物信息學(xué)分析。利用巢式PCR擴(kuò)增出DAZL基因的CDS區(qū)，并將其克隆至pMD19-T載體中。酶切及測序結(jié)果均表明pMD19-T-DAZL構(gòu)建正確，與公布的雞DAZL基因CDS區(qū)同源性達(dá)99％，編碼氨基酸完全一致。說明克隆的DAZL基因正確無誤，可以用于后續(xù)研究。
　　2.重組表達(dá)載體構(gòu)建

3、及DAZL蛋白亞細(xì)胞定位的研究。分別構(gòu)建真核表達(dá)載體DAZL-pEGFP-N1和pcDNA-DAZL，采用LipofectaminTM LTX介導(dǎo)重組表達(dá)載體pEGFP-C1-DAZL轉(zhuǎn)染雞胚胎成纖維細(xì)胞(CEF)，48 h后于熒光倒置顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染有DAZL-pEGFP-N1的細(xì)胞，并利用RT-PCR和Western Blot迸一步鑒定Dazl-eGFP mRNA和蛋白水平的表達(dá)情況;轉(zhuǎn)染有pcDNA-DAZL的實(shí)驗(yàn)組采用間接免疫熒

4、光(IFA)鑒定DAZL蛋白在CEF中的表達(dá)部位。結(jié)果顯示，RT-PCR、Western Blot均能檢測到融合蛋白的表達(dá)，熒光顯微鏡觀察Dazl-eGFP融合蛋白主要分布于細(xì)胞核，IFA檢測結(jié)果也顯示DAZL蛋白位于細(xì)胞核，與生物信息學(xué)軟件預(yù)測結(jié)果相一致。
　　3.雞胚胎干細(xì)胞無飼養(yǎng)層培養(yǎng)體系的建立。采用藥匙法從新鮮受精蛋中分離獲取cESC，并通過補(bǔ)充外源細(xì)胞因子以無飼養(yǎng)層法進(jìn)行培養(yǎng)，待其形成大克隆后，用口吸管剝離法挑取cESC

5、克隆，用膠原酶Ⅳ-胰酶兩步消化法進(jìn)行cESC傳代，并采用生化和免疫學(xué)方法鑒定其干細(xì)胞活性。結(jié)果表明無飼養(yǎng)層培養(yǎng)體系體外培養(yǎng)cES細(xì)胞能穩(wěn)定傳代至第6代，鑒定結(jié)果顯示堿性磷酸酶(AKP)陽性和階段特異性胚胎抗原1(SSEA-1)陽性，指明克隆能保持未分化狀態(tài)，可以用于后續(xù)的誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)。
　　4.DAZL誘導(dǎo)雞胚胎干細(xì)胞分化為生殖干細(xì)胞的研究。設(shè)計(jì)質(zhì)粒量800 ng、900 ng、1000 ng三個(gè)水平，質(zhì)粒、脂質(zhì)體比1∶1.5、1

6、∶2、1∶2.5三個(gè)體系轉(zhuǎn)染cESC，通過二因素比較優(yōu)化LipofactiminTM LTX介導(dǎo)法轉(zhuǎn)染體系。重組載體pcDNA-DAZL體外轉(zhuǎn)染cESC，G418篩選獲得陽性克隆，間接免疫熒光檢測DAZL蛋白的表達(dá)，然后更換培養(yǎng)基進(jìn)行分化培養(yǎng)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測相關(guān)基因表達(dá)量，IFA檢測誘導(dǎo)細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記。結(jié)果顯示質(zhì)粒900 ng、質(zhì)脂比為1∶2時(shí)，可獲得最佳轉(zhuǎn)染效率;過表達(dá)DAZL基因會(huì)抑制Nanog表達(dá)，誘導(dǎo)St