胚胎后腎細胞微環(huán)境誘導胚胎干細胞向腎臟細胞分化的實驗研究.pdf

1、目的： 胚胎干細胞（Embryonic Stem Cells，ESCs）由于具備強大的自我更新及多向分化潛能等特性，可作為再生醫(yī)學中種子細胞的新來源，受到廣大學者的普遍關注。有關ESCs向腎細胞誘導分化的研究起步相對較晚，近年才見部分報道。體外研究表明，ESCs經特定的細胞因子誘導可向一定類型的腎細胞分化；體內研究表明，后腎細胞微環(huán)境在誘導ESCs向腎臟細胞分化過程中起重要作用。本研究通過體外共培養(yǎng)方式模擬后腎細胞微環(huán)境，探討

2、其對ESCs向腎細胞方向分化的誘導作用，為研究ESCs向腎系細胞分化提供新的實驗模式，并為探索后腎細胞微環(huán)境中影響ESCs向腎系細胞分化的關鍵因子打下實驗基礎。 方法： 1.以小鼠胚胎成纖維細胞作為飼養(yǎng)層傳代培養(yǎng)小鼠D3系ESCs，RT-PCR法鑒定多潛能標志基因Oct4、Nanog和Sox2的表達。 2.通過懸滴法將ESCs制備成擬胚體（Embryoil Bodies，EBs），將EBs分為共培養(yǎng)組和自然

3、分化組。共培養(yǎng)組：通過Transwells系統(tǒng)將EBs與孕12.5天的胎鼠后腎細胞進行間接接觸共培養(yǎng)；自然分化對照組：常規(guī)方法培養(yǎng)EBs，令其自然分化。 3.采用免疫熒光細胞化學染色法觀察后腎細胞微環(huán)境對EBs表達腎小管細胞標志物Pax2和腎足細胞標志物WT1的影響。 4.采用RT-PCR方法觀察胚胎后腎細胞微環(huán)境對EBs表達腎臟發(fā)育相關基因（Pax2、WT1、GDNF、Emx2、BMP-7、Nephrin和KSP）

4、及腎祖細胞標志CD24基因的影響。 結果： 1.ESCs在飼養(yǎng)層細胞上呈集落樣生長，RT-PCR結果顯示其多潛能標志基因Oct4、Sox2、Nanog強表達，說明用于本實驗的ESCs處于未分化狀態(tài)。 2.免疫熒光細胞化學染色結果顯示，共培養(yǎng)組EBs第3天即可見Pax2陽性細胞，且隨著共培養(yǎng)時間延長，Pax2陽性細胞逐漸增多，且可見部分陽性細胞成簇排列，形態(tài)類似圓環(huán)狀，而自然分化組EBs于第7天見少數(shù)Pax2

5、陽性細胞，經統(tǒng)計分析，共培養(yǎng)組Pax2陽性細胞數(shù)顯著高于自然分化組（P<0.05）；共培養(yǎng)組EBs第3天即可見WT1陽性細胞，且隨著共培養(yǎng)時間延長，WT1陽性細胞逐漸增多，而自然分化組EBs未見WT1陽性細胞。表明間接接觸共培養(yǎng)方式模擬的胚胎后腎細胞微環(huán)境可促進ESCs向腎小管細胞和腎足細胞分化。 3.RT-PCR結果顯示，與自然分化組比較，共培養(yǎng)早期，后腎細胞微環(huán)境可促進后腎發(fā)育早期基因（Pax2、WT1）、后腎發(fā)育中期基因

6、（Emx2、GDNF、BMP7）及腎祖細胞標志CD24基因的表達，隨著共培養(yǎng)時間的延長，后腎發(fā)育晚期基因（Nephrin、KSP）的表達增強，而后腎發(fā)育早期基因（Pax2、WT1）及后腎發(fā)育中期基因（Emx2、GDNF、BMP7）的表達減弱。提示間接接觸共培養(yǎng)方式模擬的胚胎后腎細胞微環(huán)境可調控ESCs表達后腎發(fā)育相關基因。 結論： 間接接觸共培養(yǎng)方式模擬的胚胎后腎細胞微環(huán)境可誘導ESCs向腎系細胞分化，并可調控后腎發(fā)