胚胎后腎組織體外誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向腎干細(xì)胞分化實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景和目的： 慢性腎臟疾病(Chronic kidney disease，CKD)發(fā)病率不斷增加，在成人中的發(fā)生率已達(dá)10％，其主要特征是細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix，ECM)過度沉積和纖維化，引起腎功能進(jìn)行性下降，發(fā)展的最終結(jié)局是終末期腎衰(end stage renal disease，ESRD)，目前只能依賴血透、腹透和腎移植來治療。血透、腹透只能部分替代腎臟的濾過功能。腎移植供體短缺、抗排異藥物副

2、作用大，這些治療方法均存在嚴(yán)重缺陷。尋找更完美的新治療方法和途徑是腎臟病工作者迫在眉睫的任務(wù)。 近來研究發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)具有高度可塑性(plasticity)，在體的胚胎組織可誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向腎干細(xì)胞(renal stem cells)或腎臟固有細(xì)胞分化，異種胚胎組織也可誘導(dǎo)入骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向腎干細(xì)胞或腎臟固有細(xì)胞分化，但在胚胎內(nèi)誘導(dǎo)

3、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向腎干細(xì)胞分化無臨床應(yīng)用前景，因?yàn)殡y以從胚胎組織中分離純化由骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化而來的腎干細(xì)胞。如果能在體外誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為腎干細(xì)胞，則誘導(dǎo)的細(xì)胞可被輕而易舉地分離和純化，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。 大量資料表明，干細(xì)胞的分化發(fā)育及其發(fā)育方向，取決于其所處的微環(huán)境(microenvironment)。在后腎發(fā)育過程中，后腎間充質(zhì)細(xì)胞(metanephric mesenchymecells，MMCs)即胚腎

4、干細(xì)胞，具有自我更新及多向分化的能力，除了集合管起源于輸尿管芽(ureteric bud，UB)外，后腎間充質(zhì)細(xì)胞分化形成所有的腎單位和基質(zhì)細(xì)胞，在離開胚腎組織仍能發(fā)育成腎固有細(xì)胞，這提示胚腎組織具有干細(xì)胞微環(huán)境特征。 鑒于以上科學(xué)研究背景，本課題擬在體外，用Transwell小室共培養(yǎng)體系，將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與后腎間充質(zhì)細(xì)胞和輸尿管芽分室共培養(yǎng)，利用胚腎組織按內(nèi)在規(guī)律釋放的可溶性因子，誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向腎干細(xì)胞分化，觀察誘

5、導(dǎo)后的干細(xì)胞在體外誘導(dǎo)輸尿管芽分枝的能力，為以后探討誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向腎干細(xì)胞分化所需的調(diào)控因子及建立單純用誘導(dǎo)因子在體外誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向腎干細(xì)胞分化的方法提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為腎臟組織工程研究以及將來采用腎干細(xì)胞在纖維化的腎組織形成有功能的新腎單位的實(shí)驗(yàn)研究提供充足的無免疫原性的腎臟種子細(xì)胞。 方法： 1.用密度梯度離心和貼壁培養(yǎng)相結(jié)合的方法分離培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)及生長特點(diǎn)，四唑鹽

6、比色法(Methylthio tetrazole，MTT)觀察細(xì)胞增殖及更新能力，透射電鏡觀察細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期及細(xì)胞表面CD44、CD45、CD90分子的表達(dá)，免疫細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞波形蛋白(Vimentin)、纖維連接蛋白(Fibronectin，F(xiàn)N)、角蛋白(Keratin)、E-鈣粘蛋白(E-cadherins)、CD34等的表達(dá)，同時(shí)對培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行成脂、成骨誘導(dǎo)分化，采用油紅(Oil red)0染色及骨鈣素(

7、osteocalcim，OCN)觀察大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化情況。細(xì)胞鑒定后，將其接種于細(xì)胞外基質(zhì)膠中進(jìn)行三維立體(three-dimensional，3D)培養(yǎng)，倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞在細(xì)胞外基質(zhì)膠中的形態(tài)變化，激光掃描共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞外基質(zhì)膠不同層面的細(xì)胞形態(tài)。 2.在解剖顯微鏡下分離孕13.5d(E13.5d)大鼠胚胎，獲取胚胎后腎并去除輸尿管芽，將胚胎后腎間充質(zhì)細(xì)胞以組織塊法進(jìn)行原代培養(yǎng)，用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞

8、形態(tài)演變，MTT法觀察細(xì)胞增殖及更新能力，透射電鏡和掃描電鏡觀察細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)和表面結(jié)構(gòu)，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期及細(xì)胞表面CD44、CD45、CD90分子的表達(dá)，免疫細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞Vimentin、Fibronectin、Keratin、E-cadherins及CD34的表達(dá)，同時(shí)進(jìn)行細(xì)胞多向誘導(dǎo)分化(成脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞)實(shí)驗(yàn)，分別采用油紅O及OCN染色觀察誘導(dǎo)分化情況。細(xì)胞鑒定后，將其接種于細(xì)胞外基質(zhì)膠中進(jìn)行三維立體培養(yǎng)，倒置相差顯

9、微鏡觀察細(xì)胞在細(xì)胞外基質(zhì)膠中的形態(tài)變化，激光掃描共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞外基質(zhì)膠不同層面的細(xì)胞形態(tài)變化。 3.在解剖顯微鏡下分離孕13.5d(E13.5d)大鼠胚胎，獲取胚胎后腎，消化法得到完整的輸尿管芽，將其種植于Transwell小室上室中的細(xì)胞外基質(zhì)膠中，后腎間充質(zhì)細(xì)胞種植于Transwell小室下室中，二者進(jìn)行分室共培養(yǎng)，倒置相差顯微鏡下觀察輸尿管芽的形態(tài)，免疫細(xì)胞技術(shù)對其進(jìn)行鑒定，激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察輸尿管芽的形態(tài)變

10、化。 4.建立大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向腎干細(xì)胞分化的體外誘導(dǎo)共培養(yǎng)模型，并分為5組，A：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞+后腎間充質(zhì)細(xì)胞；B：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞+輸尿管芽；C:骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞+后腎間充質(zhì)細(xì)胞+輸尿管芽；D:骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；E：空白對照組。用倒置相差顯微鏡觀察誘導(dǎo)后的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)變化，流式細(xì)胞儀檢測誘導(dǎo)后細(xì)胞周期及細(xì)胞表面CD44、CD45、CD90分子的表達(dá)，免疫熒光化學(xué)法檢測誘導(dǎo)后細(xì)胞的細(xì)胞標(biāo)志物Vimentin、

11、Fibronectin、Keratin、E-cadherins蛋白的表達(dá)。誘導(dǎo)后細(xì)胞與輸尿管芽共培養(yǎng)，用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察誘導(dǎo)后細(xì)胞對輸尿管芽的誘導(dǎo)能力。 結(jié)果： 1.大鼠原代BMSCs呈集落樣生長，細(xì)胞形態(tài)呈梭形，傳代后細(xì)胞生長迅速，形態(tài)比較均一，大部分細(xì)胞為成纖維樣或多角形，細(xì)胞增殖能力強(qiáng)，具有自我更新能力；透射電鏡結(jié)果顯示細(xì)胞核較大，核呈橢圓形或不規(guī)則形，有核突，含有1-2個(gè)核仁，胞漿內(nèi)含有粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體

12、，其他細(xì)胞器較少，胞漿內(nèi)可見分泌小泡，表現(xiàn)出未分化細(xì)胞的特征；細(xì)胞周期結(jié)果顯示，只有少數(shù)細(xì)胞進(jìn)入增殖活躍期，大部分細(xì)胞處于靜止期；流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面分子標(biāo)志物的結(jié)果顯示，細(xì)胞強(qiáng)表達(dá)CD44、CD90，不表達(dá)CD45；免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示BMSCs明顯表達(dá)Vimentin、Fibronectin，不表達(dá)Keratin、E-cadherin及CD34； BMSCs在特定誘導(dǎo)條件下可以向脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞分化，加入成脂肪誘導(dǎo)培養(yǎng)基3w

13、后，細(xì)胞內(nèi)可見多個(gè)折光性強(qiáng)的圓形脂肪滴，油紅O染色呈紅色；在加入成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)后，可見圓形或卵圓形礦化結(jié)節(jié)，OCN表達(dá)陽性。在本實(shí)驗(yàn)中，大鼠BMSCs在由80％I型膠原與20％的微量生長因子基質(zhì)膠組成的細(xì)胞外基質(zhì)膠中生長狀態(tài)較好。 2.培養(yǎng)的大鼠MMSCs貼壁生長，梭形，成纖維細(xì)胞樣，單個(gè)核，核仁大，，形態(tài)均一，細(xì)胞增殖能力強(qiáng)，具有自我更新能力；透射電鏡結(jié)果顯示，細(xì)胞為長梭形或不規(guī)則形狀，核不規(guī)則，核仁大，胞漿中滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)

14、達(dá)，可見分泌顆粒；掃描電鏡結(jié)果示，細(xì)胞呈梭形或多角形，核仁明顯，細(xì)胞連接緊密，表面有微絨毛突起，梭形細(xì)胞胞漿向兩極伸出長突起，多角形細(xì)胞突起呈樹枝狀，緊緊貼于蓋玻片上；細(xì)胞周期結(jié)果顯示，90％以上的細(xì)胞處于靜止期，只有少部分細(xì)胞處于增殖期；流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，幾乎所有細(xì)胞都明顯表達(dá)CD44、CD90，幾乎所有細(xì)胞不表達(dá)CD45；免疫細(xì)胞化學(xué)染色法結(jié)果顯示，大鼠MMSCs明顯表達(dá)間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白Vimentin、Fibronecti

15、n，不表達(dá)Keratin、E-cadherin及CD34；細(xì)胞在特定誘導(dǎo)條件下具有多向分化能力，可以向脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞分化，誘導(dǎo)分化后的脂肪細(xì)胞油紅0染色呈特異性紅色，OCN表達(dá)呈陽性，并可形成鈣結(jié)節(jié)。倒置相差顯微鏡下觀察三維立體培養(yǎng)的大鼠MMSCs結(jié)果顯示，不同層面細(xì)胞都呈長梭形，培養(yǎng)2-3d可見細(xì)胞連接，細(xì)胞增殖能力強(qiáng)；激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察可見三維立體培養(yǎng)的細(xì)胞明顯表達(dá)Vimentin，F(xiàn)ibronectin，不表達(dá)Kera

16、tin及E-cadherin。三維立體培養(yǎng)體系中，大鼠MMSCs形狀立體感強(qiáng)，生長狀態(tài)好。 3.倒置相差顯微鏡下觀察E13.5d大鼠的UB呈T形，接種于細(xì)胞外基質(zhì)中不斷分枝發(fā)芽。激光掃描共聚焦顯微鏡下，用FITC-DB標(biāo)記UB，結(jié)果顯示大鼠UB以二叉分枝方式進(jìn)行分枝、生長，UB頂端的細(xì)胞生長迅速，其頸部細(xì)胞較頂端(壺腹)部細(xì)胞的生長速度慢。隨著生長時(shí)間的延長，大鼠UB不斷以二叉分枝方式擴(kuò)展延伸，逐漸形成樹狀結(jié)構(gòu)。 4.倒

17、置相差顯微鏡下觀察誘導(dǎo)后的大鼠BMSCs，結(jié)果顯示細(xì)胞生長密集，界限不清，呈梭形；流式細(xì)胞儀檢測誘導(dǎo)后的細(xì)胞周期結(jié)果顯示，90％以上的細(xì)胞處于靜止期，只有少部分細(xì)胞處于增殖期；流式細(xì)胞儀檢測誘導(dǎo)后的細(xì)胞表面標(biāo)記物，結(jié)果顯示幾乎所有細(xì)胞都明顯表達(dá)CD44、CD90，幾乎所有細(xì)胞不表達(dá)CD45；免疫熒光檢測誘導(dǎo)后的細(xì)胞結(jié)果顯示，大鼠后腎間充質(zhì)干細(xì)胞明顯表達(dá)間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白Vimentin。Fibronectin，不表達(dá)上皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白Ke

18、ratin及E-cadherin:激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察到C組誘導(dǎo)后的細(xì)胞對大鼠UB有誘導(dǎo)作用，C組的UB以二叉分枝的方式分枝發(fā)芽。 結(jié)論： 1.我們成功分離培養(yǎng)了大鼠BMSCs和MMSCs，這些細(xì)胞具有典型的間充質(zhì)細(xì)胞形態(tài)及干細(xì)胞表型，具有多向分化能力。 2.我們成功分離、培養(yǎng)、鑒定了大鼠UB。 3.我們建立了大鼠BMSCs在體外向腎干細(xì)胞分化模型，實(shí)現(xiàn)了BMSCs向腎干細(xì)胞的轉(zhuǎn)型。在體外誘導(dǎo)后的大