體外誘導骨髓間充質(zhì)干細胞向內(nèi)耳毛細胞分化的實驗研究.pdf

1、南昌大學醫(yī)學院碩士學位論文體外誘導骨髓間充質(zhì)干細胞向內(nèi)耳毛細胞分化的實驗研究姓名：楊永明申請學位級別：碩士專業(yè)：耳鼻咽喉科學指導教師：江紅群20100601摘要Corti氏器。再加入2ml025％胰蛋白酶(含EDTAlmmol／L)置入37℃孵箱8min進行消化，中止消化并離心后棄去上清液，接種于細胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。3分化細胞的基因表達分析：分兩組：空白對照組及共培養(yǎng)組?？瞻讓φ战M是指取第四代MSCs，按(5104cells／m1)密度接

2、種于6孔板，不與耳蝸Corti氏器細胞共培養(yǎng)，滴加有EGF／bFGF／IGF—l以及N2和B27的DMEM／F12(1：1)無血清培養(yǎng)液，隔日換液一次，連續(xù)14天，再收集培養(yǎng)細胞。共培養(yǎng)組是指取第四代MSCs，按上述培養(yǎng)條件，與耳蝸Corti氏器細胞共培養(yǎng)14天，再收集分化細胞，將收集的兩組細胞分別提取總RNA，用于RTPCR鑒定。4分化細胞的免疫細胞化學鑒定：用毛細胞的標志物(Myosin7A、Mathl、Calretinin)對分化

3、細胞進行免疫細胞化學鑒定。結(jié)果：1培養(yǎng)第四代的MSCs為均一的“紡錘形”，呈漩渦樣生長，細胞熒光化學染色為CD29()、CD90()、CDll7()、CD34(一)CD45(一)，符合大鼠MSCs的特征。2MSCs與耳蝸Corti氏器細胞共培養(yǎng)2周后行免疫細胞化學鑒定示分化細胞能表達毛細胞的特異性標志物Myosin7A、Mathl、Calretinin，其中Myosin7A是目前認為特異性比較高的毛細胞標志物，Mathl在毛細胞形成早期

4、即有表達一直到成熟期，Calretinin為前庭毛細胞早期特異性分子標志物。3空白對照組未見毛細胞標志物mRNA的表達。共培養(yǎng)組可見在Marker為500bp、750bp的電泳條帶之間，出現(xiàn)擴增片段長度為624bp的Myosin7A電泳條帶以及擴增片段長度為545bp的Mathl電泳條帶。結(jié)論：1體外已成功將骨髓間充質(zhì)干細胞誘導分化為具有內(nèi)耳毛細胞分子特征的毛細胞樣細胞。2耳蝸Corti氏器細胞可能分泌多種調(diào)節(jié)因子，誘導骨髓間充質(zhì)干細胞