體外模擬心肌微環(huán)境下胚胎干細(xì)胞向心肌樣細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：探討完整成熟心肌細(xì)胞或心肌細(xì)胞裂解物對(duì)胚胎干細(xì)胞(embryonic stem eells,ESCs)定向分化為心肌細(xì)胞的誘導(dǎo)作用及強(qiáng)度。 方法：收集昆明小鼠3.5d和4d胚齡的囊胚，分別將其培養(yǎng)在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層上，4～5d后取隆起生長的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)分離后再培養(yǎng)，觀察集落的生長情況并通過堿性磷酸酶染色、OCT-4染色等對(duì)細(xì)胞集落進(jìn)行鑒定。然后取3～4代ESCs,先將ESCs懸浮培養(yǎng)2～3d形成擬胚體(embryoid

2、 bodies，EBs)，再用大鼠心肌細(xì)胞等誘導(dǎo)因素對(duì)其誘導(dǎo)培養(yǎng)。共分5組進(jìn)行定向誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，即心肌細(xì)胞誘導(dǎo)組、心肌細(xì)胞條件培養(yǎng)液誘導(dǎo)組、心肌細(xì)胞裂解液誘導(dǎo)組、胚胎干細(xì)胞分化培養(yǎng)液誘導(dǎo)組和對(duì)照組。ESCs分化為心肌細(xì)胞的結(jié)果判斷，用相差顯微鏡觀察EBs搏動(dòng)情況，用免疫細(xì)胞熒光技術(shù)檢測(cè)心肌細(xì)胞特異性肌鈣蛋白T(TnT)、a-肌動(dòng)蛋白(a-Actin)的表達(dá)。 結(jié)果： ①采用0.1％胰蛋白酶-0.02％EDTA室溫作用2-4分

3、鐘并輔以機(jī)械作用，分離克隆ESCs效果較好。 ②心肌細(xì)胞誘導(dǎo)組：誘導(dǎo)分化培養(yǎng)第3天起有EBs自發(fā)性、有節(jié)律跳動(dòng)，12d時(shí)有93％的EBs出現(xiàn)節(jié)律性收縮。已分化的ESCs特異性肌鈣蛋白T、a-Actin陽性表達(dá)率56.5±13.44％，顯著高于其它各組(P＜0.05)。 ③心肌細(xì)胞條件培養(yǎng)液誘導(dǎo)組：12d時(shí)有8％的EBs出現(xiàn)節(jié)律性收縮。已分化的：ESCs肌鈣蛋白T、a-Actin陽性表達(dá)率5.2±2.01％，顯著低于心肌細(xì)

4、胞誘導(dǎo)組(P＜0.05)，與對(duì)照組比較差異無顯著性(P＞0.05)。 ④心肌細(xì)胞裂解液誘導(dǎo)組：12d時(shí)有36％的EBs出現(xiàn)節(jié)律性收縮。已分化的ESCs特異性肌鈣蛋白T、a-Actin陽性表達(dá)率8.24±2.45％，顯著低于心肌細(xì)胞誘導(dǎo)組(P＜0.05)，顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)。 ⑤胚胎干細(xì)胞分化培養(yǎng)液誘導(dǎo)組：12d時(shí)有7％的EBs出現(xiàn)節(jié)律性收縮。已分化的ESCs特異性肌鈣蛋白T、a-Actin陽性表達(dá)率5.08±