模擬心肌微環(huán)境中BMP-2誘導(dǎo)大鼠BM-MSCs向心肌樣細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:建立心肌細(xì)胞與BM-MSCs共培養(yǎng)體系,探討在模擬心肌微環(huán)境中,BMP-2對(duì)BM-MSCs向心肌細(xì)胞分化的影響。
　　 方法:
　　 (1)大鼠心肌細(xì)胞、BM-MSCs分離培養(yǎng)。
　　 (2)用BMP-2誘導(dǎo)BM-MSCs分化,分別建立不同濃度的BMP-2作用組,誘導(dǎo)14天后,經(jīng)RT-PCR方法檢測(cè)BM-MSCs心肌特異性轉(zhuǎn)錄因子(NKX2.5、GATA4、Mef2c)以及成熟心肌細(xì)胞特異性基因(cTnI、

2、ANP、α-MHC、β-MHC)核酸表達(dá),確定BMP-2對(duì)BM-MSCs誘導(dǎo)作用的最佳作用濃度。
　　 (3)應(yīng)用最佳濃度的BMP-2誘導(dǎo)與心肌細(xì)胞共培養(yǎng)的BM-MSCs,分為六組:A組:骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組;B組:BM-MSCs+心肌細(xì)胞+Noggin組:C組:BM-MSCs+心肌細(xì)胞組;D組:BM-MSCs+心肌細(xì)胞+BMP-2誘導(dǎo)組;E組:BM-MSCs+心肌細(xì)胞+Noggin(共培養(yǎng)3天后撤除)+BMP-2誘導(dǎo)組;F組:心

3、肌細(xì)胞組。
　　 (4)應(yīng)用RT-PCR和免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)BM-MSCs心肌特異性轉(zhuǎn)錄因子(NKX2.5、GATA4、Mef2c)和成熟心肌細(xì)胞特異性基因(cTnI、ANP、α-MHC、β-MHC)的核酸表達(dá),分析BMP-2在心肌細(xì)胞旁分泌作用下對(duì)BM-MSCs向心肌細(xì)胞分化的影響。
　　 結(jié)果:
　　 (1)細(xì)胞培養(yǎng)成功進(jìn)行心肌細(xì)胞、BM-MSCs分離、純化、鑒定及擴(kuò)增,建立心肌細(xì)胞/BM-MSCs共培養(yǎng)的

4、方法體系。
　　 (2)BMP-2誘導(dǎo)BM-MSCs分化的最佳作用濃度與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組相比較,經(jīng)不同濃度BMP-2誘導(dǎo)的BM.MSCs中α-MHC、β-MHC、NKX2.5表達(dá)顯著增強(qiáng);然而,心肌細(xì)胞特異性標(biāo)記GATA4、Mef2c、cTnI、ANP的表達(dá)變化不明顯,其差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。不同濃度作用組相比較,0.5組α-MHC、β-MHC、NKX2.5表達(dá)顯著增強(qiáng),組間差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 (3)在心肌微環(huán)境

5、中BMP-2對(duì)BM-MSCs向心肌細(xì)胞分化的影響RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,與A組比較,B組α-MHC、β-MHC、NKX2.5、GATA4、MEF2C、cTnI、ANP表達(dá)無(wú)明顯變化;C、D和E組的心肌細(xì)胞早期轉(zhuǎn)錄因子和心肌特異性標(biāo)記的表達(dá)明顯增強(qiáng),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;其中E組的各指標(biāo)表達(dá)最強(qiáng),與其他各組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。免疫熒光染色結(jié)果顯示,A、B組偶見(jiàn)cTnI+細(xì)胞。C、D和E組均見(jiàn)較多cTnI+細(xì)胞。統(tǒng)計(jì)分析顯示,E組和C組與