人胚胎干細(xì)胞源性心外膜細(xì)胞向心肌成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)分化.pdf

1、心肌細(xì)胞約占心臟總體積的75％，但其細(xì)胞數(shù)量只占有心臟細(xì)胞總數(shù)的30%-40%。整個心臟約2/3細(xì)胞為非心肌細(xì)胞，其中絕大多數(shù)為心肌成纖維細(xì)胞（CF, cardiac fibroblast）。心肌成纖維細(xì)胞能夠分泌細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）構(gòu)成心臟骨架、傳導(dǎo)機(jī)械-電信號、分泌因子促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖和冠狀動脈血管生成等。在心肌損傷時，隨著細(xì)胞因子侵襲、細(xì)胞死亡及炎性物質(zhì)滲透，心肌成纖維細(xì)胞被激活轉(zhuǎn)變成肌性成纖維細(xì)胞，從而導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)合成和降解之

2、間的平衡打破，細(xì)胞外基質(zhì)的過度合成會導(dǎo)致纖維組織的發(fā)育形成瘢痕組織。因其受限于人類心臟組織的獲取及無有效的心肌成纖維分離方法，對于心肌成纖維細(xì)胞在心臟發(fā)育及病理狀態(tài)下功能的研究僅來源于模式研究。體外通過人胚胎干細(xì)胞(hESC,human embryonic stem cell)產(chǎn)生心肌成纖維細(xì)胞能夠克服這種困難并提供無盡的細(xì)胞來源進(jìn)行體外功能研究及體內(nèi)模型試驗(yàn)，同時為心臟組織工程提供功能性心肌成纖維細(xì)胞奠定了基礎(chǔ)。
　　心肌成纖維

3、細(xì)胞主要來源于心外膜細(xì)胞。心外膜細(xì)胞來源于形成在心房心室環(huán)路形成時的前心外膜器官(PEO，proepicardial organ)。小鼠E10.5、禽類E3、人類發(fā)育第4周，心外膜細(xì)胞覆蓋整個心臟表面。心外膜細(xì)胞覆蓋整個心臟表層后，部分心外膜細(xì)胞進(jìn)行上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT, Epithelial-mesenchymal transition）形成心外膜源性細(xì)胞（EPDCs, epicardium-derived cells），并遷移侵襲

4、至心肌細(xì)胞層，剩余細(xì)胞仍覆蓋在心臟表面。遷移侵入到心肌細(xì)胞之間的EPDCs在多種信號通路作用下能夠繼續(xù)分化形成心肌成纖維細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞等。心外膜細(xì)胞表達(dá)特異性標(biāo)記因子WT1、ALDH1A2和TBX18等，進(jìn)行EMT形成EPDCs后，其表達(dá)水平迅速降低并開始表達(dá)EMT標(biāo)記因子SNAIL1和SNAIL2等，進(jìn)一步分化形成心肌成纖維細(xì)胞表達(dá)其特異性標(biāo)記因子TCF21、DDR2、COL1A1、TBX20、GATA4、POSTN、CD90、

5、HAND2等。心肌成纖維細(xì)胞的發(fā)育過程受多種信號通路調(diào)控。研究表明TGFβ，PDGF，Wnt/β-Catenin等促進(jìn)心外膜細(xì)胞進(jìn)行EMT，Retinoic Acid，F(xiàn)GFs，VEGF等信號通路在EPDCs分化形成心肌成纖維細(xì)胞過程中起到重要的調(diào)控作用。目前，尚無研究能夠在體外通過調(diào)節(jié)信號通路誘導(dǎo)分化形成功能性的人心肌成纖維細(xì)胞。
　　本研究以人胚胎干細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對象，在BMP4和CHIR-99021作用下將其誘導(dǎo)分化形成成熟心外

6、膜細(xì)胞，進(jìn)而研究TGF-β1、PDGFBB和IWP2對心外膜細(xì)胞行上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化形成 EPDCs過程中的調(diào)控作用及 bFGF、PDGFBB和SB-431542協(xié)同促進(jìn) EPDCs分化形成心肌成纖維細(xì)胞的作用。建立兩步誘導(dǎo)將人胚胎干細(xì)胞源性心外膜細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化形成心肌成纖維細(xì)胞的體系，并對獲得心肌成纖維細(xì)胞功能進(jìn)行鑒定。
　　本課題針對以上相關(guān)問題從以下四個方面進(jìn)行研究：第一部分：誘導(dǎo)分化人胚胎干細(xì)胞形成成熟心外膜細(xì)胞并對其進(jìn)行鑒

7、定，選取形成成熟心外膜細(xì)胞最佳時間，為進(jìn)一步進(jìn)行心肌成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)分化提供正確穩(wěn)定的細(xì)胞來源；第二部分：采用不同濃度TGF-β1、PDGFBB和IWP2作用于hESC源性心外膜細(xì)胞，選取出最有效促進(jìn)EMT的濃度組合，并進(jìn)一步探討進(jìn)行EMT的最佳時間；第三部分：在第二部分基礎(chǔ)上，采用不同濃度bFGF、PDGFBB和SB-431542作用于 EPDCs，對形成細(xì)胞進(jìn)行鑒定并探討特異性形成心肌成纖維細(xì)胞的最佳濃度及時間；第四部分：利用已經(jīng)建立

8、的兩步法特異性誘導(dǎo)hESC源性心外膜細(xì)胞分化形成心肌成纖維細(xì)胞，對其進(jìn)行傳代培養(yǎng)，觀察其在傳代過程中的穩(wěn)定性并對其功能進(jìn)行鑒定。
　　第一部分
　　研究目的：
　　誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞分化形成心外膜細(xì)胞，為心肌成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)分化提供細(xì)胞來源。
　　研究方法：
　　采用HESC2-RFP（NIH code ES02）細(xì)胞系誘導(dǎo)分化形成心外膜細(xì)胞。D0-D1， hESCs在BMP4作用下分化成擬胚體。D1-D4，擬

9、胚體在BMP4和Activin A作用下誘導(dǎo)分化成心臟中胚層。D4-D6，心臟中胚層在BMP4和CHIR-99021特異性誘導(dǎo)分化下形成心外膜前體細(xì)胞（P-epi）。D6-D15，心臟中胚層持續(xù)分化增殖形成前體心外膜細(xì)胞。D15-D27，前體心外膜細(xì)胞增殖形成成熟心外膜細(xì)胞(EPI， epicardium)。利用WT1、ALDH1A2和TBX18等心外膜細(xì)胞特異性標(biāo)記因子從細(xì)胞分子水平、mRNA表達(dá)水平和蛋白表達(dá)水平對其進(jìn)行鑒定。在D1

10、5,D21,D24,D27分別取心外膜前體細(xì)胞和心外膜細(xì)胞，對其特異性標(biāo)記的表達(dá)水平進(jìn)行檢測，選取成熟心外膜細(xì)胞形成的最佳時期。同時，相同方法分化形成心臟中胚層，D4-D6，VEGF和IWP2特異性誘導(dǎo)心臟中胚層分化為心肌細(xì)胞（CM）作為對照。
　　結(jié)果：
　　1. D15 CM,D15 P-epi和D27 EPI表達(dá)Aldeflour的陽性細(xì)胞率分別為8.64%，16.9%和93.6%；WT1陽性細(xì)胞率分別為12.0%,3

11、5.9%和90.4%；CD90陽性細(xì)胞率分別為17.6%，62.3%和79.9%；cTNT陽性細(xì)胞率分別為72.4%，19.6%和8.5%；
　　2. D15 P-epi和D27 EPI在mRNA水平上表達(dá)WT1、ALDH1A2、TBX18、ISL1、CD90、BNC1、ANA8、GPM6A、UPK1B、KRT8和 KRT19等心外膜標(biāo)記因子，而D15 CM低表達(dá)。D15 CM、D15 P-epi和D27EPI均表達(dá)TCF21、G

12、ATA4和GATA5。相比較于D15 CM表達(dá)心肌細(xì)胞標(biāo)記因子TNNT2和MEF2C，D15 P-epi和D27 EPI細(xì)胞不表達(dá)；
　　3.免疫熒光結(jié)果顯示D27 EPI細(xì)胞核中表達(dá)WT1,細(xì)胞質(zhì)中不表達(dá)cTNT。CD15 CM細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)cTNT，細(xì)胞核中不表達(dá)WT1；
　　4. D27 EPI高表達(dá)心外膜特異性標(biāo)記因子，是誘導(dǎo)分化形成成熟心外膜細(xì)胞的最佳時期。
　　結(jié)論：
　　人胚胎干細(xì)胞在BMP4和CHI

13、R-99021作用下，特異性誘導(dǎo)分化形成成熟心外膜細(xì)胞。誘導(dǎo)分化形成心外膜細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)心外膜特異性標(biāo)記因子，為進(jìn)一步建立心肌成纖維誘導(dǎo)分化體系提供了基礎(chǔ)。
　　第二部分
　　研究目的：
　　研究TGF-β1、PDGFBB和IWP2是否能夠共同作用調(diào)控hESC源性心外膜細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化
　　研究方法：
　　采用人胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化形成心外膜細(xì)胞為研究對象，不同濃度TGF-β1(0ng/ml、0.1ng/m

14、l、0.3ng/ml、1ng/ml、3ng/ml)，聯(lián)合不同濃度PDGFBB（0ng/ml、1ng/ml、10ng/ml、30ng/ml）作用72h。RT-PCR和Flow cytometry從mRNA水平和細(xì)胞分子水平檢測心外膜細(xì)胞標(biāo)記因子的表達(dá)，進(jìn)行上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞會失表達(dá)。1ng/ml TGF-β1和1ng/ml PDGFBB組為最佳，但其分化效率有限。在此基礎(chǔ)上，1ng/ml TGF-β1、1ng/ml PDGFBB和不同濃度

15、IWP2（0μM，0.1μM，0.3μM，1μM，3μM，5μM）作用72h。RT-PCR和Flow cytometry從mRNA水平和細(xì)胞分子水平檢測心外膜細(xì)胞標(biāo)記因子的表達(dá)，進(jìn)行上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞會失表達(dá)。同時，1ng/ml TGF-β1、1ng/ml PDGFBB分別和100ng/ml Wnt3a，100ng/ml Wnt5a，150ng/ml DKK1,0.5μM CHIR-99021作用72h對IWP2協(xié)同促進(jìn)EMT作用進(jìn)行驗(yàn)

16、證。1ng/ml TGF-β1、1ng/ml PDGFBB和0.3μM IWP2組分化效率最高，達(dá)到90%以上。從細(xì)胞形態(tài)學(xué)角度，觀察上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化后細(xì)胞形態(tài)變化。為了確定EMT最佳時期，1ng/ml TGF-β1、1ng/ml PDGFBB和0.3μM IWP2組分別作用于hESC源性心外膜細(xì)胞24h、48h和72h，通過RT-PCR和Flow cytometry從mRNA水平和細(xì)胞分子水平檢測心外膜細(xì)胞標(biāo)記因子表達(dá)水平的變化。免疫熒

17、光染色進(jìn)一步證實(shí)TGF-β1、PDGFBB和IWP2聯(lián)合作用有效促進(jìn)hESC源性心外膜細(xì)胞經(jīng)EMT轉(zhuǎn)化成EPDCs。
　　結(jié)果：
　　1.單獨(dú)采用TGF-β1可促進(jìn)hESC源性心外膜細(xì)胞行EMT，但細(xì)胞數(shù)量會明顯下降。1ng/ml TGF-β1、1ng/ml PDGFBB聯(lián)合作用能夠促進(jìn) EMT，但其分化效率有限；
　　2.1ng/ml TGF-β1、1ng/ml PDGFBB和0.3μM IWP2為誘導(dǎo)EMT的最佳濃

18、度組合，分化效率達(dá)90%以上。Wnt3a，Wnt5a和CHIR-99021不能促進(jìn)EMT；
　　3.1ng/ml TGF-β1、1ng/ml PDGFBB和0.3μM IWP2作用后，從形態(tài)學(xué)上，卵圓形心外膜細(xì)胞轉(zhuǎn)化為細(xì)長形間質(zhì)細(xì)胞；
　　4.48h為1ng/ml TGF-β1、1ng/ml PDGFBB和0.3μM IWP2誘導(dǎo)EMT的最佳時間；
　　5.免疫熒光結(jié)果顯示經(jīng)過EMT得到的EPDCs不表達(dá)WT1、ZO1

19、和α-SMA，而表達(dá)Vemitin。
　　結(jié)論：
　　TGF-β1、PDGFBB和IWP2聯(lián)合作用48h能夠有效促進(jìn)hESC源性心外膜細(xì)胞進(jìn)行EMT。
　　第三部分
　　研究目的：
　　研究bFGF、PDGFBB和SB-431542是否能夠共同作用調(diào)控hESC源性心外膜細(xì)胞形成的EPDCs特異性分化形成心肌成纖維細(xì)胞
　　研究方法：
　　采用 hESC源性心外膜細(xì)胞經(jīng)EMT后形成的EPDCs為研

20、究對象。在添加和不添加SB-431542的條件下，采用不同濃度bFGF(0ng/ml、3ng/ml、10ng/ml)，聯(lián)合不同濃度PDGFBB（0ng/ml、10ng/ml、30ng/ml）作用72h。RT-PCR從mRNA水平上觀察WT1、ALDH1A2、CD90、MYH11、TCF21和EPOR表達(dá)變化。添加SB-431542的條件下，3ng/ml bFGF和10ng/ml PDGFBB組為誘導(dǎo)分化形成心肌成纖維細(xì)胞的最佳濃度。進(jìn)而

21、，采用不同濃度SB-431542（0μM，0.1μM，0.3μM，1μM，3μM，6μM）作用72h。RT-PCR和Flow cytometry從mRNA水平和細(xì)胞分子水平檢測心肌成纖維細(xì)胞標(biāo)記因子的表達(dá)。3ng/ml bFGF、10ng/ml PDGFBB和3μM SB組為誘導(dǎo)EPDCs分化形成心肌成纖維細(xì)胞的最佳組合。為了確定心肌成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)分化最佳時間，3ng/ml bFGF、10ng/ml PDGFBB和3μM SB-4315

22、42組分別作用于 EPDCs24h、48h和72h，通過 RT-PCR和 Flow cytometry從mRNA水平和細(xì)胞分子水平檢測特異性心肌成纖維細(xì)胞標(biāo)記因子的表達(dá)水平。免疫熒光染色進(jìn)一步證實(shí)bFGF、PDGFBB和SB-431542聯(lián)合作用有效誘導(dǎo)EPDCs分化形成心肌成纖維細(xì)胞。
　　結(jié)果：
　　1.3ng/ml bFGF、10ng/ml PDGFBB和3μM SB-431542組誘導(dǎo)分化形成細(xì)胞表達(dá)心肌成纖維細(xì)胞標(biāo)

23、記因子 CD90、DDR2、POSTN、Col1A1、TCF21、HAND2、EPOR和GATA4等，不表達(dá)WT1、ALDH1A2和MYH11；
　　2.3ng/ml bFGF、10ng/ml PDGFBB和3μM SB誘導(dǎo)分化形成心肌成纖維細(xì)胞中CD90+Aldeflour-細(xì)胞占66.5%；
　　3.72h為3ng/ml bFGF、10ng/ml PDGFBB和3μM SB-431542誘導(dǎo)EPDCs分化形成心肌成纖維細(xì)

24、胞的最佳時間；
　　4.誘導(dǎo)分化形成心肌成纖維細(xì)胞形態(tài)學(xué)上為梭形，單個或多個細(xì)胞核；
　　5.免疫熒光結(jié)果顯示誘導(dǎo)分化得到心肌成纖維細(xì)胞不表達(dá) WT1、ZO1和α-SMA，而表達(dá)Vemitin。
　　結(jié)論：
　　在bFGF、PDGFBB和SB-431542聯(lián)合作用72h下，hESC源性心外膜細(xì)胞形成的EPDCs有效分化形成心肌成纖維細(xì)胞。
　　第四部分
　　研究目的：
　　研究hESC源性心外膜

25、細(xì)胞在體外誘導(dǎo)分化形成的心肌成纖維細(xì)胞，是否能夠進(jìn)行傳代培養(yǎng)，傳代培養(yǎng)過程中其特性是否發(fā)生改變及對其功能進(jìn)行鑒定。
　　研究方法：
　　采用 hESC源性心外膜細(xì)胞經(jīng)過兩步法誘導(dǎo)分化形成的心肌成纖維細(xì)胞為研究對象。待細(xì)胞密度達(dá)到80%-90%時，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，多次重復(fù)此步驟。通過RT-PCR和Flow cytometry從mRNA水平和細(xì)胞分子水平檢測心肌成纖維細(xì)胞特異性標(biāo)記因子表達(dá)水平。免疫熒光檢測其在蛋白水平表達(dá)心肌成纖

26、維細(xì)胞標(biāo)記因子的表達(dá)情況。將傳代培養(yǎng)獲得成熟心肌成纖維細(xì)胞與人胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化形成心肌細(xì)胞以不同比率共同培養(yǎng)，觀察其相互作用。
　　結(jié)果：
　　1.誘導(dǎo)分化形成心肌成纖維細(xì)胞能夠穩(wěn)定傳代，第二代時標(biāo)記因子表達(dá)水平最高；
　　2.心肌成纖維細(xì)胞傳代過程中保持形態(tài)學(xué)上細(xì)長或者梭形，單個或多個細(xì)胞核；
　　3.不同代數(shù)心肌成纖維細(xì)胞CD90+Aldeflour-細(xì)胞百分比均在80%以上；
　　4.不同代數(shù)心肌成

27、纖維細(xì)胞在mRNA水平均表達(dá)CD90、DDR2、POSTN、Col1A1、TCF21、HAND2和GATA4等，不表達(dá)WT1、ALDH1A2，低表達(dá)MYH11；
　　5.免疫熒光結(jié)果顯示不同代數(shù)心肌成纖維細(xì)胞均不表達(dá) WT1、ZO1和α-SMA，而表達(dá)Vemitin；
　　6. hESC源性心外膜細(xì)胞表面不表達(dá)EPOR，而不同代數(shù)心肌成纖維細(xì)胞表面表達(dá)EPOR，陽性細(xì)胞百分率達(dá)50%以上；
　　7.傳代心肌成纖維細(xì)胞能