人胚胎干細胞向心室和心房肌細胞分化和富集的研究.pdf

1、心肌梗死是造成人類死亡的四大主要疾病之一,該疾病會導致心肌細胞數量缺失,進一步導致病人死亡。由于成年化的心肌細胞不能分裂,具有不可再生性,因此,應用心肌細胞移植治療心肌梗死已經成為一個新的的研究熱點。
　　 近年來,隨著對人胚胎干細胞(Human Embryonic Stem Cells,hESCs)的深入研究,使得應用胚胎干細胞來源的心肌細胞治療心肌梗死成為可能。胚胎干細胞具有全能性,在體內外特定的條件下,能定向分化為三個胚層

2、來源的各種類型的細胞,包括心肌細胞。胚胎干細胞分化的心肌細胞和胎兒形成早期的心肌細胞在電生理、鈣運作、肌原纖維結構和心肌收縮蛋白的表達等各個方面都有很大的相似性。然而,胚胎干細胞分化的心肌細胞存在異質性,利用這種異質的心肌細胞進行移植,會導致心律不齊,因此,獲得純度較高的心肌細胞是進行心肌細胞移植的前提條件。
　　 α肌球蛋白重鏈(alpha-myosin heavy chain,αMHC)在胚胎干細胞分化為心肌細胞初期特異性表

3、達,并且其表達量隨分化時間的增加呈現(xiàn)上調趨勢,而指導其特異性表達的是αMHC基因啟動子。因此,αMHC基因的啟動子能夠作為調控序列對胚胎干細胞分化的心肌細胞進行標記,使其易于被識別和分離純化,從而進行心肌細胞的移植治療。
　　 本研究的目的在于構建含有心肌特異性啟動子αMHC的滅瘟素(Blasticidin,簡稱Blar)抗性基因以及綠色熒光蛋白(Enhanced green fluorescent protein,EGFP)基

4、因的慢病毒表達載體αMHC-Blar-2A-EGFP-Rex-neo,應用慢病毒轉染技術將慢病毒轉染至人胚胎干細胞,通過篩選穩(wěn)定轉染的人胚胎干細胞并誘導其分化為心肌細胞,進一步分離純化胚胎干細胞源的心肌細胞。
　　 本研究內容及結果如下:
　　 1、重組慢病毒表達載體的構建、鑒定以及擴增
　　 應用PCR技術克隆出滅瘟素(Blar)抗性基因和口蹄疫病毒(Foot and mouthdisease virus,FM

5、DV)的具有自剪切功能的多肽2A序列,2A序列能夠使同一啟動子啟動的多基因平衡表達。將Blar-2A片段插入慢病毒載體αMHC-EGFP-Rex-neo,構建含有αMHC啟動子的滅瘟素抗性基因以及綠色熒光蛋白基因的多順反子慢病毒表達載體αMHC-Blar-2A-EGFP-Rex-neo,通過酶切及測序鑒定后,對慢病毒載體進行擴增。將重組慢病毒載體與psPAX2、pMD2.G載體共同轉染293T包裝細胞,運用磷酸鈣轉染技術包裝出完整的重組

6、慢病毒。
　　 2、慢病毒轉染人胚胎干細胞及穩(wěn)定細胞株的獲得
　　 將獲得的慢病毒感染低代數的人胚胎干細胞,由于轉染后的人胚胎干細胞帶有人胚胎干細胞特異性的啟動子Rex,能啟動新霉素(Neomycin,neo)抗性蛋白的表達。因此,用藥物G418篩選,能獲得轉染成功的人胚胎干細胞。光學顯微鏡下機械挑取單克隆細胞,并進行擴大培養(yǎng),應用PCR技術檢測是否獲得穩(wěn)定轉染的人胚胎干細胞,將穩(wěn)定轉染的人胚胎干細胞命名為neo-hES

7、Cs。進一步,對neo-hESCs進行核型分析,經過鑒定,轉染的人胚胎干細胞具有正常的二倍體核型,說明慢病毒轉染并不改變人胚胎干細胞的核型,為進一步從細胞水平探討特異性啟動子介導的心肌細胞篩選純化奠定了基礎。
　　 3、體外誘導分化心肌細胞、藥物篩選及鑒定
　　 將neo-hESCs經視黃酸信號通路直接誘導分化為心室肌細胞和心房肌細胞。誘導分化第10天,心肌細胞開始跳動。提取分化第9天、10天、12天的心肌細胞RNA,反

8、轉錄為cDNA,檢測αMHC的表達情況。結果表明,分化第9天,心肌細胞即表達αMHC。于熒光顯微鏡下觀察EGFP的表達情況,發(fā)現(xiàn)有EGFP的表達,并且表達區(qū)域呈現(xiàn)跳動的狀態(tài),表明分化的心肌細胞表達EGFP。
　　 誘導分化第10天,用藥物滅瘟素篩選心肌細胞,每隔24小時更換含滅瘟素的心肌細胞培養(yǎng)基。加藥篩選的第3天,跳動的心肌細胞開始聚團,非心肌細胞部分已經死亡。篩選第4天,對照組中的細胞全部死亡,而實驗組中存活的心肌細胞聚團跳

9、動,將篩選后的心肌細胞命名為Blar-2A-EGFP-cardiomyocytes。于熒光顯微鏡下觀察Blar-2A-EGFP-cardiomyocytes,觀察到有EGFP表達。對Blar-2A-EGFP-cardiomyocytes進行心肌特異性肌鈣蛋白T(Cardiac troponin T,cTnT)的免疫熒光染色,于熒光顯微鏡下觀察有cTnT的表達,表明neo-hESCs分化的心肌細胞具有正常心肌細胞的典型特征。應用FACS技

10、術篩選Blar-2A-EGFP-cardiomyocytes,鑒定其純度。篩選結果表明,心室肌細胞的純度達到95%,心房肌細胞的純度達到93%。
　　 進一步,對心室肌細胞和心房肌細胞這兩種心肌細胞亞型做分子特征分析。IRX4(Iroquois homeobox protein4)是心室肌細胞特異性表達基因,能促進心室肌細胞的發(fā)育。因此,本實驗提取了篩選后的心室肌和心房肌細胞的RNA,通過Real time-PCR檢測兩者IRX