人胚胎干細(xì)胞體內(nèi)向肌細(xì)胞分化的研究.pdf

1、人胚胎干細(xì)胞(bumail embryonic stem cells，hES細(xì)胞)是能向多種細(xì)胞類型分化的全(多)能性干細(xì)胞，如何將這類細(xì)胞誘導(dǎo)分化成骨骼肌細(xì)胞，為治療肌肉退行性疾病，如杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥(Duchenn's Muscular Dystrophy，DMD)，提供足夠數(shù)量的細(xì)胞來(lái)源，一直是干細(xì)胞分化研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。本研究針對(duì)這一問(wèn)題進(jìn)行探討，以人ES細(xì)胞系SHES 39作為實(shí)驗(yàn)材料，成功的將SHES 39細(xì)胞在體外誘導(dǎo)成骨骼

2、肌細(xì)胞的前體細(xì)胞。建立合適的小鼠肌肉損傷模型后，將這些前體細(xì)胞移植入小鼠肌肉中，能進(jìn)一步整合分化為骨骼肌細(xì)胞和肌肉組織干細(xì)胞——衛(wèi)星細(xì)胞。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下： 1.為了建立合適的肌肉損傷模型，對(duì)20 μg心肌毒素(cardiotoxin)單獨(dú)處理以及處理24小時(shí)后輔以X-射線局部照射小鼠脛骨前肌這兩種方案進(jìn)行比較，并對(duì)18，25和50Gy的照射劑量進(jìn)行比較。病理檢查的結(jié)果證實(shí)：心肌毒素能在注射部位對(duì)肌肉造成嚴(yán)重破壞，大部分骨

3、骼肌細(xì)胞變性壞死；輔以25Gy的X-射線局部照射能明顯抑制肌細(xì)胞損傷后內(nèi)源性細(xì)胞的修復(fù)增生，大大提高人源性細(xì)胞的整合率(28.65％±13.69％，P<0.01)。另外，18Gy的照射劑量也可達(dá)到相似效果，但50Gy的照射劑量效果相對(duì)較差。 2.利用經(jīng)典遺傳學(xué)的雜交-互交方法，將8周齡的非糖尿病-嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷(NOD/scid)雄鼠(scid-/-)與mdx純合雌鼠(mdx-/-相雜交，再用其所生的8周齡Fl代雄鼠(scid

4、+/-/mdx-/-)和雌鼠(scid+/-/mdx+/-)互交，提取46只F2代雜合子小鼠的基因組DNA，對(duì)dystrophin以及scid基因進(jìn)行PCR檢測(cè)，共獲得13只雙基因缺陷的純合小鼠(scid-/-/mdx-/-)，作為研究杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥的免疫缺陷型動(dòng)物模型。 3.人胚胎干細(xì)胞懸浮培養(yǎng)，誘導(dǎo)分化成類胚體，在合適培養(yǎng)液中貼壁后繼續(xù)分化生長(zhǎng)，多次傳代，直至形成類似于成纖維細(xì)胞樣的骨骼肌前體細(xì)胞后，將這些前體細(xì)胞植入經(jīng)

5、心肌毒素+25Gy X-射線局部照射聯(lián)合處理的NOD-SCID小鼠脛骨前肌。為了確定最佳的細(xì)胞移植時(shí)間，分別在照射后O小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)三個(gè)時(shí)點(diǎn)進(jìn)行細(xì)胞移植的實(shí)驗(yàn)。免疫組化結(jié)果表明：照射后24小時(shí)或48小時(shí)進(jìn)行移植的外源細(xì)胞整合率相對(duì)較高，分別為24.32％和23.48％。 4.心肌毒素+25Gy X-射線局部照射聯(lián)合處理NOD-SCID小鼠24小時(shí)后，將hES來(lái)源的前體細(xì)胞移植到NOD-SCID小鼠的脛骨前肌中，2-16

6、周后取材做冰凍切片，隨后的免疫組化和原位雜交結(jié)果證實(shí)，約10％-20％的細(xì)胞能整合分化成骨骼肌細(xì)胞，并表達(dá)人特異性的dystrophin基因，部分細(xì)胞能分化成為衛(wèi)星細(xì)胞，并表達(dá)衛(wèi)星細(xì)胞的相關(guān)標(biāo)志，如pax7等。將這些細(xì)胞以同樣方式移植入免疫缺陷的杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥的動(dòng)物模型-scid/mdx小鼠肌肉后，也能整合分化成骨骼肌細(xì)胞并表達(dá)dytrophin基因。 5.在hES細(xì)胞來(lái)源的前體細(xì)胞移植后14-128天的共12只小鼠(26處移