人胚胎干細胞系與人孤雌胚胎干細胞系建立的研究.pdf

1、目的：胚胎干細胞是一類來源于哺乳動物原始生殖細胞和囊胚內(nèi)細胞團的全能細胞，主要具有兩方面顯著特征:一是具有體外高度增殖和自我更新的能力，二是可被定向誘導分化成體內(nèi)各種細胞類型。孤雌激活來源的人胚胎干細胞的基因型與卵子提供者的基因型完全相同，由其誘導分化的細胞用于機體移植完全不會引起免疫排斥。因此，人胚胎干細胞尤其是人孤雌胚胎干細胞具有巨大的醫(yī)學研究價值與應用前景，如再生醫(yī)學、人類發(fā)育生物學和細胞治療等。本實驗旨在建立穩(wěn)定的、標準化的人胚

2、胎干細胞體外培養(yǎng)方法，并且在保證人胚胎干細胞長期穩(wěn)定傳代培養(yǎng)的基礎上，比較不同飼養(yǎng)層對維持人胚胎干細胞生長的作用影響，從而優(yōu)化人胚胎干細胞的培養(yǎng)條件。與此同時，對培養(yǎng)體系進行改良，利用廢棄卵母細胞獲得的孤雌囊胚在改良的完全人源性培養(yǎng)條件下建立最接近臨床標準的人孤雌胚胎干細胞系，為臨床級人孤雌胚胎干細胞研究與應用奠定基礎。
　　對象與方法：本實驗收集天津市中心婦產(chǎn)科醫(yī)院生殖醫(yī)學中心試管嬰兒治療患者的不成熟卵母細胞和移植后剩余無凍存價

3、值的廢棄胚胎，征得患者夫婦雙方同意并簽署知情同意書后用于本實驗。應用人包皮成纖維細胞作為飼養(yǎng)層，85％KnockOut DMEM、15％KnockOut血清替代物、4ng/mlbFGF培養(yǎng)基，建立人胚胎干細胞系，并且對其特異性標志物SSEA-3、SSEA-4、SSEA-1、TRA-1-60、TRA-1-81、轉錄因子Oct-4，堿性磷酸酶，體內(nèi)或體外分化能力作全面的鑒定。同時，對小鼠胚胎成纖維細胞、人包皮成纖維細胞、人胚胎肺組織成纖維細

4、胞三種飼養(yǎng)層的形態(tài)、性狀、維持人胚胎干細胞生長能力如干細胞平均克隆形成數(shù)量、未分化克隆率進行比較，篩選出本實驗室條件下最適合的人胚胎干細胞飼養(yǎng)層，并且應用這種飼養(yǎng)層細胞建立人孤雌胚胎干細胞系。應用不成熟人卵母細胞作為研究對象，體外培養(yǎng)成熟后，采用電脈沖聯(lián)合6-DMAP孤雌激活及自發(fā)激活獲得孤雌囊胚，同時改良人孤雌胚胎干細胞的培養(yǎng)體系，完全應用人源性培養(yǎng)基、人源性飼養(yǎng)層細胞，并且在操作中盡量減少異源性因素干擾，使建立的人孤雌胚胎干細胞系最

5、大可能接近臨床級應用標準。
　　結果：利用本實驗室建立的人胚胎干細胞培養(yǎng)方法和改良的同源性培養(yǎng)體系，分別建立了人胚胎干細胞系H-TJ1、H-TJ2和人孤雌胚胎干細胞系P-TJ，體外長期擴增均超過30代，經(jīng)鑒定分別保持人胚胎干細胞和人孤雌胚胎干細胞的特性。接種在三種飼養(yǎng)層上的人胚胎干細胞均可以維持克隆樣生長，生物學鑒定均符合人胚胎干細胞標準，但不同飼養(yǎng)層上克隆的形態(tài)差異大。相比于兩種人來源飼養(yǎng)層，小鼠胚胎成纖維細胞作為經(jīng)典的飼養(yǎng)層可

6、以獲得最多的人胚胎干細胞克隆，而作為同源性飼養(yǎng)層細胞，人包皮成纖維細胞飼養(yǎng)層明顯優(yōu)于另兩種飼養(yǎng)層細胞，能很好地維持人胚胎干細胞增殖和未分化狀態(tài)。
　　結論：本研究成功建立了人胚胎干細胞和人孤雌胚胎干細胞培養(yǎng)體系，應用廢棄胚胎和經(jīng)體外成熟的M1、GV期卵母細胞分離得到了人胚胎干細胞系和人孤雌胚胎干細胞系，并且維持其人胚胎干細胞特性和人孤雌胚胎干細胞特性。人包皮成纖維細胞作為同源性飼養(yǎng)層細胞，不僅可以避免異源性污染并且可以維持人胚胎干