小鼠三種胚胎干細(xì)胞系表觀相關(guān)基因的分析.pdf

1、細(xì)胞核的重編程可以通過(guò)將體細(xì)胞的細(xì)胞核移入卵母細(xì)胞，將體細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞進(jìn)行融合，以及向體細(xì)胞中轉(zhuǎn)入幾個(gè)轉(zhuǎn)錄因子例如Oct4，Sox2，C-myc，Klf4和 Nanog的方法實(shí)現(xiàn)，然而細(xì)胞核的重編程需要經(jīng)歷復(fù)雜的過(guò)程，其中最為重要的就是細(xì)胞核所發(fā)生的表觀遺傳學(xué)變化，本文主要綜訴了細(xì)胞核重編程的研究概況，產(chǎn)生干細(xì)胞的四種不同的方法和現(xiàn)代表觀遺傳學(xué)中干細(xì)胞的表觀遺傳學(xué)特性以及體細(xì)胞的表觀遺傳學(xué)變化。
　　 我們從培養(yǎng)ES細(xì)胞著手，

2、通過(guò)一年的摸索初步建立了小鼠胚胎成纖維細(xì)胞的體外培養(yǎng)平臺(tái)，并在此基礎(chǔ)上利用小鼠胚胎成纖維細(xì)胞經(jīng)過(guò)絲裂霉素c處理的方法建立了合格的胚胎細(xì)胞滋養(yǎng)層。同時(shí)綜合國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)，采用對(duì)小鼠注射激素，超數(shù)排卵，沖取3.5天的受精卵，接種于小鼠胚胎成纖維細(xì)胞制作的滋養(yǎng)層細(xì)胞上，在體外培養(yǎng)下使受精卵正常發(fā)育，并孵化，進(jìn)而使受精卵在體外貼壁，等內(nèi)細(xì)胞團(tuán)長(zhǎng)大時(shí)用機(jī)械的方法挑取內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，從而建立了三株小鼠的胚胎干細(xì)胞系，經(jīng)過(guò)分子水平的鑒定，基本確定細(xì)胞系的成功。

3、
　　 基于胚胎細(xì)胞完整的培養(yǎng)體系，我們成功培養(yǎng)了ES細(xì)胞系，核移植胚胎干細(xì)胞系，IPS細(xì)胞系各兩株，在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)擴(kuò)大后分別提取了各個(gè)細(xì)胞系的總RNA。在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)定量引物，分別分析了與胚胎細(xì)胞表觀相關(guān)的表觀遺傳學(xué)基因，主要包括與DNA甲基化相關(guān)的基因Dnmt1、Dnmt3b、Dnmt3L、Aicda、與H3K27me3相關(guān)的基因Ezh2 Kdm6b Kdm6a，與H3K4me相關(guān)的基因 mllI LSDI與Histone A

4、c相關(guān)的基因Kat2a，以一株細(xì)胞ES細(xì)胞系作為對(duì)照，利用2-△△Ct法分析了這些基因在六株細(xì)胞系中的變化，結(jié)果顯示，在6個(gè)細(xì)胞系中ntES2 在各個(gè)基因中都比同類以及其他細(xì)胞系表達(dá)量要高，特別是在Dnmt1基因中要比同類細(xì)胞高出5倍多，由于此細(xì)胞在體外傳代次數(shù)較長(zhǎng)已達(dá)到25代，因此有可能在體外傳代過(guò)程中引起細(xì)胞表觀修飾的改變，此現(xiàn)象已在文獻(xiàn)中有報(bào)道，對(duì)于此細(xì)胞系進(jìn)一步的鑒定還需要進(jìn)行。
　　 與H3K27me3相關(guān)的基因Ezh

5、2、Kdm6b、Kdm6a、與H3K4me相關(guān)的基因 mllI LSDI與Histone Ac相關(guān)的基因Kat2a 在六個(gè)細(xì)胞系中的表達(dá)量均未表現(xiàn)出變化。
　　 與DNA甲基化相關(guān)的基因中，Dnmt1基因在各個(gè)細(xì)胞系中的表達(dá)沒(méi)有表現(xiàn)出很明顯的變化，而Dnmt3b基因在兩株IPS細(xì)胞系中的表達(dá)量要比正常的ES細(xì)胞和核移植干細(xì)胞系低將近2倍。相反，Dnmt3L基因在兩株IPS細(xì)胞系中的表達(dá)量比正常的ES細(xì)胞和核移植ES細(xì)胞系高將近4