豬胚胎干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、鑒定和分化的研究.pdf

1、甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文豬胚胎干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、鑒定和分化的研究姓名：況玲申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：臨床獸醫(yī)學(xué)指導(dǎo)教師：余四九馮書堂20040601中文摘要胚胎干細(xì)胞是從哺乳動物的早期囊胚內(nèi)細(xì)胞和原始生殖細(xì)胞中分離、體外培養(yǎng)所獲得的多能性干細(xì)胞。多能干細(xì)胞是研究哺乳動物胚胎早期發(fā)育、細(xì)胞分化、基因調(diào)控等發(fā)育生物學(xué)基本問題的理想模型，在組織工程學(xué)，藥理學(xué)、家畜品種改良、動物轉(zhuǎn)基因和動物克隆等方面具有重要的研究和應(yīng)用價(jià)值。嵌合體是鑒定EG細(xì)

2、胞多能性的方法之一，同時(shí)嵌合體的制作，也是EG細(xì)胞在研究發(fā)育遺傳以及細(xì)胞分化過程中基因表達(dá)和調(diào)控的有效手段。精原干細(xì)胞是成體干細(xì)胞中唯一貫穿于整個(gè)生命過程中并能夠自我更新和傳輸遺傳基因到后代的細(xì)胞，對于雄性生殖力的恢復(fù)和生殖系基因修復(fù)精原干細(xì)胞具有重要的意義。本文以豬為試驗(yàn)材料，通過多方面的研究，對其原始生殖細(xì)胞建立EG細(xì)胞系的影響因素進(jìn)行了研究，并就豬EG細(xì)胞的鑒定和體外誘導(dǎo)分化的方法進(jìn)行了探索；通過對豬嵌合體的制作及對其進(jìn)行的DNA

3、分析，進(jìn)一步證實(shí)EG細(xì)胞具有胚胎干細(xì)胞的多能性；此外，本文對豬精原干細(xì)胞的分離和培養(yǎng)進(jìn)行了探討。通過研究，我們獲得了如下結(jié)論：(1)通過對265以9天的94個(gè)豬胚胎進(jìn)行胚胎成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)，證實(shí)其能夠作為成纖維細(xì)胞培養(yǎng)的材料，也證明豬成纖維細(xì)胞可以用做飼養(yǎng)層細(xì)胞的制作以及作為動物克隆的核供體細(xì)胞。(2)作為EG細(xì)胞的飼養(yǎng)層細(xì)胞，STO細(xì)胞要求細(xì)胞形態(tài)整齊、邊緣清晰、生長旺盛、立體感強(qiáng)，用絲裂酶素C處理后，其形態(tài)沒有變化；將PGC細(xì)胞接種

4、到STO細(xì)胞7～10天后，STO細(xì)胞沒有出現(xiàn)發(fā)暗和空泡化等凋亡現(xiàn)象，能保證EG細(xì)胞集落的正常生長而不分化和凋亡。(3)作為培養(yǎng)EG細(xì)胞的豬胚胎，其胎齡不能超過28天，否則PGC將失去對刺激生長因子的反應(yīng)，開始出現(xiàn)分化，并沒有EG細(xì)胞集落的形成。通過對19個(gè)29天胚齡的豬胚胎的培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)沒有胚胎形成EG細(xì)胞集落。(4)通過對Es專用胎牛血清、Hyclone特級胎牛血清和四季青優(yōu)級胎牛血清的比較，作為EG細(xì)胞的培養(yǎng)，Es專用血清質(zhì)量最好、四