豬胚胎干細(xì)胞分離培養(yǎng)與OCT4-eGFP示蹤體系細(xì)胞篩選.pdf

1、胚胎干細(xì)胞(ESC)是一種多能性細(xì)胞，具有自我更新無(wú)限增殖的能力，具有向體內(nèi)各胚層細(xì)胞分化的能力。嵌合實(shí)驗(yàn)表明，胚胎干細(xì)胞具有生殖系嵌合能力，將性狀遺傳到下一代，這也是胚胎干細(xì)胞獨(dú)有的特性。應(yīng)用這一特性，可嵌合生成基因修飾動(dòng)物?；蛐揎梽?dòng)物在基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)的研究，藥物實(shí)驗(yàn)的研究，疾病的研究有廣泛的應(yīng)用，因此胚胎干細(xì)胞在醫(yī)學(xué)研究和動(dòng)物性狀改變研究有很重要的意義。目前，小鼠、大鼠和人胚胎干細(xì)胞技術(shù)已經(jīng)成熟，而大動(dòng)物還沒(méi)有成熟的胚胎干細(xì)胞技術(shù)平臺(tái)。

2、豬是人類疾病的良好動(dòng)物模型，也是異種器官移植的理想材料。而豬ESC作為研究性狀改良、胚胎發(fā)育和醫(yī)學(xué)模型的理想工具。因此，探索豬ESC細(xì)胞的適宜培養(yǎng)條件非常必要。
　　 本實(shí)驗(yàn)首先觀察豬早期體外胚胎的形態(tài)和測(cè)量直徑;通過(guò)降低孔板液體量提高囊胚貼壁率;比較雙因子培養(yǎng)液和四因子培養(yǎng)液對(duì)豬ESC分離的影響;以得到的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)對(duì)分離真正的豬胚胎干細(xì)胞進(jìn)行探討。為了能直觀的觀察分離得到的豬ESC克隆的多能性基因表達(dá)和優(yōu)化培養(yǎng)體系，我們利用TA

3、LEN介導(dǎo)同源重組，將帶有2A肽序列的增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(eGFP)基因及兩側(cè)帶有LoxP位點(diǎn)的neo抗性基因定點(diǎn)插入Oct-4基因第5外顯子的終止密碼子處，利用內(nèi)源性O(shè)ct4啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)Oct4和eGFP表達(dá)，通過(guò)克隆技術(shù)得到精確模擬內(nèi)源性O(shè)ct4表達(dá)的囊胚。已通過(guò)篩選獲得OCT4-eGFP定點(diǎn)敲入細(xì)胞。經(jīng)CRE酶處理后，該細(xì)胞制備的克隆囊胚在分離豬ESC過(guò)程中可借助OCT4-eGFP熒光標(biāo)記來(lái)確定分離得到的pES克隆是否表達(dá)Oct4基

4、因，有利于pES多能性鑒定和培養(yǎng)體系的優(yōu)化。主要的實(shí)驗(yàn)方法和實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:
　　 第一部分我們對(duì)豬早期體外胚胎進(jìn)行形態(tài)觀察和直徑測(cè)量。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，豬體外早期胚胎的胚齡與直徑成正比。同一胎齡的核移植胚胎、孤雌胚胎之間發(fā)育不同步，用胎齡對(duì)豬早期體外胚胎進(jìn)行劃分是不科學(xué)的。孤雌胚胎的貼壁率要高于核移植胚胎(37.1％，22.8％)，降低孔板液體量可以有效的提高體外胚胎的貼壁效率(22.8％，59％)(P＜0.05)。隨后用豬體外胚胎

5、進(jìn)行胚胎干細(xì)胞的分離。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)兩組培養(yǎng)液進(jìn)行比較:用雙因子培養(yǎng)液我們得到了上皮樣集落，并傳三個(gè)代次，但RT-PCR鑒定結(jié)果該細(xì)胞克隆表達(dá)Cdx2基因，并不表達(dá)Oct4基因。用四因子培養(yǎng)液分離得到2個(gè)小集落，集落傳代后不增殖。
　　 第二部分通過(guò)剪取豬耳，建立豬耳成纖維細(xì)胞系WPF17-1和WPF17-2。耳成纖維細(xì)胞藥物壓力篩選結(jié)果顯示300μg/mL濃度為篩選的適宜濃度。將構(gòu)建好的Donor質(zhì)粒線性化后與TALEN mRNA共