昆明小鼠胚胎干細胞分離培養(yǎng)及其向原始生殖細胞誘導分化的研究.pdf

1、目前，已建立的小鼠ES細胞系大多來源于129、C57BL/6J和BALB/C品系的小鼠，昆明小鼠作為我國科研工作中常用的實驗動物，其建系的報道較少，因此建立昆明小鼠胚胎干細胞系對我國深入而便利地開展ES細胞以及其它生命科學領域的研究具有重要意義。SC1是一種小分子化學物，可以雙重抑制Ras-GAP和ERK1，維持胚胎干細胞未分化狀態(tài)。另外，近幾年，已有多篇關于胚胎干細胞(Embryonicstemcells，ES細胞)在體外誘導條件下分

2、化為原始生殖細胞(Primordialgermcells，PGCs)，并進一步生成成熟配子的報道，但ES細胞向生殖細胞的誘導效率很低。本研究用昆明小鼠胚胎作為試驗對象，比較了不同培養(yǎng)條件對昆明小鼠ES細胞分離培養(yǎng)的影響，研究了小分子化學物(Pluripotin，SC1)對昆明小鼠ES細胞未分化狀態(tài)的維持作用，并用視黃酸(Retinoicacid，RA)對分離到的ES細胞向PGCs誘導分化進行了初步研究，為昆明小鼠ES細胞建系及向生殖細胞

3、的體外分化研究提供參考。
　　 1.利用MTT法檢測絲裂霉素C(10μg/mL)處理不同時間后小鼠胎兒成纖維細胞(Mouseembryonicfibroblast，MEF)活力變化情況。結果表明，以3代以內MEF制備飼養(yǎng)層，用濃度為10μg/mL的絲裂霉素C處理2～2.5h，MEF活力最穩(wěn)定，可以維持小鼠胎兒成纖維細胞7d以上不增殖也不死亡，是制備飼養(yǎng)層的適宜條件。
　　 2.將見栓后3.5～4d的胚胎分別接種于密度為1

4、×104、1×105、1×106/mL的飼養(yǎng)層上，比較胚胎在不同密度飼養(yǎng)層上貼壁、內細胞團(Innercellmass，ICM)集落形成及ES細胞的克隆生長情況。同時，以無血清培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)液，研究胚胎發(fā)育階段和培養(yǎng)液中添加不同生長因子對昆明小鼠ES細胞增殖的影響。結果顯示，胚胎在密度為1×105/mL的飼養(yǎng)層上，F(xiàn)1代和F2代ES細胞集落出現(xiàn)率均顯著高于其他2組(P<0.05)。囊胚的F2代ES細胞克隆出現(xiàn)率顯著高于桑葚胚(P<0.

5、05)，培養(yǎng)液中同時添加干細胞因子(Stemcellfactor，SCF)和胰島素的胚胎貼壁率及F1、F2代ES細胞集落出現(xiàn)率顯著高于其他2組(P<0.05)。對分離的ES細胞進行形態(tài)觀察、堿性磷酸酶(Alkalinephosphatase，AKP)染色，免疫熒光染色檢測小鼠ES細胞全能性特異標志物的表達，證實所分離的ES細胞符合小鼠ES的一系列特征。由此認為，發(fā)育至囊胚的胚胎在飼養(yǎng)層密度為1×105/mL上，培養(yǎng)液中同時添加胰島素和S

6、CF適合昆明小鼠ES細胞的分離培養(yǎng)。
　　 3.比較了在含血清替代品(Knockoutserumreplacement，KSR)的高糖DMEM培養(yǎng)液中(H-DMEM)分別添加SC1和白血病抑制因子(Leukemiainhibitoryfactor，LIF)對昆明小鼠ES細胞未分化狀態(tài)的維持作用，并探討了SC1在培養(yǎng)液中的最佳濃度。以MEF為飼養(yǎng)層，以含LIF的無血清胚胎干細胞培養(yǎng)液為對照，分別用濃度為300nM、1μM、3μM的

7、SC1代替LIF對昆明小鼠胚胎進行分離培養(yǎng)。結果顯示，胚胎在添加3μmSCl的培養(yǎng)液中ICM集落形成率顯著高于對照組(P<0.05)，形成的ES集落與對照組形態(tài)差異不明顯，最高傳至第7代，并且在無飼養(yǎng)層條件下可以傳至第6代而保持未分化狀態(tài)。不同濃度SC1培養(yǎng)液中，胚胎在SC1濃度為300nM組的F2代ES細胞集落出現(xiàn)率顯著高于1μM和3μM組(P<0.05)，所分離的ES細胞AKP染色呈陽性，Oct4、Nanog、Sox2的免疫熒光染色

8、均顯陽性，具有ES細胞的特點。這一結果表明無血清培養(yǎng)液中SC1可以替代LIF用于昆明小鼠ES細胞未分化狀態(tài)的維持，并且可以在無飼養(yǎng)層條件下進行昆明小鼠ES細胞的培養(yǎng)。
　　 4.探討了RA誘導昆明小鼠ES細胞向PGCs分化的能力及適宜濃度。采用懸滴培養(yǎng)法使分離到的第3代ES細胞形成類胚體(Embryonicbodys，EBs)，將第3d形成的EBs，接在鋪有0.1％明膠的48孔板中，5個EB/孔，分別用濃度為0.2μM、1μM、