丹參及其三種單體成分體外誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:心血管疾病是目前威脅人類健康的主要疾病之一,各種病因?qū)е碌男募〖?xì)胞因缺血、缺氧而凋亡、壞死、纖維化,進(jìn)而數(shù)量減少,最終心泵功能下降是導(dǎo)致患者死亡的主要原因。隨著人類對(duì)干細(xì)胞認(rèn)識(shí)的不斷深入,利用于細(xì)胞的增殖分化潛能,再生心肌細(xì)胞,修復(fù)受損心肌組織,恢復(fù)心臟功能,已成為治療心血管疾病尤其是心功能衰竭的一種新策略。
　　 在心肌再生研究中,應(yīng)用的干細(xì)胞主要包括胚胎干細(xì)胞(ESCs)和成體干細(xì)胞(ASCs)。其中,ESCs分離于早

2、期胚胎的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM),具有自我更新、體外無限增殖、保持正常染色體核型和未分化狀態(tài)等特性。ESCs在體內(nèi)外正常分化時(shí),能產(chǎn)生3個(gè)胚層來源的所有細(xì)胞類型。因此,相對(duì)于某些成體干細(xì)胞而言,ESCs是全能性細(xì)胞,更易于體外擴(kuò)增,分化效率較高且穩(wěn)定。在體外特定培養(yǎng)條件下,ESCs可特異地向某種組織類型的細(xì)胞進(jìn)行分化,其中包括向心肌細(xì)胞的分化。然而,限制ESCs來源的心肌細(xì)胞在心臟再生治療臨床應(yīng)用中的一個(gè)主要障礙,就是心肌的低分化率所導(dǎo)致的心

3、肌細(xì)胞數(shù)量不足。由于ESCs自發(fā)性分化為心肌細(xì)胞的比率很低(約0.2％～0.5％),使得相關(guān)化學(xué)誘導(dǎo)劑和細(xì)胞因子被先后應(yīng)用于誘導(dǎo)研究,以提高心肌細(xì)胞的分化率。
　　 丹參為唇形科鼠尾草屬植物丹參(Salvia miltiorrhiza Bunge)的干燥根及根莖,作為我國(guó)傳統(tǒng)中藥,其在臨床上用于防治心腦血管疾病已有多年。臨床觀察和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均證實(shí)丹參具有廣泛而復(fù)雜的藥理學(xué)活性,包括改善微循環(huán),清除自由基,抑制血小板聚集和抗血栓形成

4、等作用,并可通過擴(kuò)張冠脈、增加冠脈血流量、防止心肌缺血、減輕鈣超載,改善能量代謝等途徑來保護(hù)心肌組織。丹參含有多種化學(xué)成分,一般按性質(zhì)可分為水溶性(主要為丹酚酸類)和脂溶性(主要為丹參酮類)兩大類。丹酚酸類和丹參酮類化合物都是丹參的主要有效成分,在藥理作用方面,丹參酮類化合物以改善血液循環(huán)、抗菌和抗炎作用為主;而丹酚酸類化合物則以抗氧化、抗凝血和細(xì)胞保護(hù)作用特別突出。
　　 本實(shí)驗(yàn)選取ESCs作為研究對(duì)象,通過檢測(cè)丹參及其單體成

5、分丹參素、丹參酮ⅡA和丹酚酸B在誘導(dǎo)ESCs向心肌細(xì)胞分化過程中,各組心肌細(xì)胞的分化率、形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)、機(jī)能學(xué)等方面的特性,探討丹參及其單體成分對(duì)心肌細(xì)胞分化的影響,以期為丌發(fā)丹參在臨床上新的應(yīng)用,以及我國(guó)傳統(tǒng)中藥介入再生醫(yī)學(xué)、組織工程等領(lǐng)域提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法:
　　 1、ESCs的培養(yǎng)與擴(kuò)增將小鼠CGR8胚胎干細(xì)胞接種于預(yù)先包被有0.2％明膠的培養(yǎng)皿中,應(yīng)用含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,于37℃、5％C

6、O2及飽和濕度條件下培養(yǎng),隔日換液,待細(xì)胞集落80％～90％融合時(shí)傳代。
　　 2、擬胚體的制備與分化培養(yǎng)以含20％胎牛血清的IMDM為分化培養(yǎng)基,將ESCs制成濃度為4～5×104個(gè)/ml的細(xì)胞懸液,采用懸滴法("hanging drop")培養(yǎng)形成擬胚體,于擬胚體形成的第4～8d分別向培養(yǎng)液中加入丹參(10mg/ml)、丹參素(10μg/ml)、丹參酮ⅡA(5μg/ml)和丹酚酸B(1μg/ml)進(jìn)行誘導(dǎo)分化。對(duì)照組僅用分化

7、培養(yǎng)液培養(yǎng)。此后隔同換液,直至檢測(cè)。
　　 3、細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性檢測(cè)將ESCs以5000個(gè)/孔的密度接種于96孔培養(yǎng)板中,置孵箱內(nèi)培養(yǎng),待其貼壁后分別加入誘導(dǎo)劑量的各組藥物,設(shè)置空白對(duì)照。于孵箱內(nèi)培養(yǎng)24h后進(jìn)行檢測(cè),具體步驟按照MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行操作,酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)550nm處各孔的吸光度(OD)值。
　　 4、細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡檢測(cè)向?qū)?shù)生長(zhǎng)期的ESCs中分別加入誘導(dǎo)劑量的各組藥物,設(shè)置空

8、白對(duì)照,于孵箱內(nèi)培養(yǎng)24h后進(jìn)行檢測(cè),具體步驟按照細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行操作,流式細(xì)胞儀分析檢測(cè)。
　　 5、計(jì)數(shù)Ebs分化率每日于顯微鏡下觀察各組Ebs的生長(zhǎng)情況及出現(xiàn)跳動(dòng)細(xì)胞的時(shí)間,以各組Ebs中出現(xiàn)跳動(dòng)的心肌合胞體為分化陽(yáng)性,并分別與每組Ebs的總數(shù)相比,所得百分比即為Ebs的自發(fā)搏動(dòng)率,即Ebs分化率。
　　 6、流式細(xì)胞分析收集分離于Ebs的單細(xì)胞懸液,調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106個(gè)/ml,以小鼠抗

9、小鼠cardiac troponin T單克隆抗體為一抗,FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG為二抗,設(shè)置空白對(duì)照,流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析。
　　 7、Ebs的免疫熒光檢測(cè)取各組形成第13d的Ebs,棄去培養(yǎng)基,PBS洗3次,4％多聚甲醛固定30min,0.2％Triton X-100透化20min,5％BSA封閉30min,以小鼠抗小鼠α-actinin為一抗,FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG為二抗,Hoechst33258染核,熒光抗淬

10、滅劑封片后,倒置熒光顯微鏡下觀察。
　　 8、分化心肌細(xì)胞的免疫熒光檢測(cè)取分離于各組Ebs并貼壁伸展后的細(xì)胞,棄液、清洗、固定、透化、封閉,一抗為兔抗小鼠cardiac troponinⅠ抗體,二抗為FITC標(biāo)記山羊抗兔IgG,Hoechst33258染核封片后,倒置熒光顯微鏡下觀察。
　　 9、雙標(biāo)法檢測(cè)分化心肌細(xì)胞的特異性蛋白抗原取分離于Ebs并貼壁伸展后的細(xì)胞,棄液、清洗、固定、透化、封閉后,同時(shí)加入兔抗小鼠car

11、diac troponinⅠ和小鼠抗小鼠α-actinin作為一抗,以FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG和PE標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG作為二抗,激光共聚焦顯微鏡下觀察。
　　 10、RT-RCR檢測(cè)MLC-2v、α-MHC和Anf的Mrna的表達(dá)提取第13d跳動(dòng)Ebs的總RNA,將其逆轉(zhuǎn)錄為Cdna,PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增,產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,凝膠成像系統(tǒng)掃描拍照。
　　 結(jié)果:
　　 1、分化后細(xì)胞形態(tài)及各組Ebs的分

12、化率 ESCs經(jīng)懸滴培養(yǎng)48h后形成白色的Ebs,貼壁培養(yǎng)4～5d后,于倒置顯微鏡下可觀察到Ebs周邊部出現(xiàn)自發(fā)性節(jié)律性收縮的心肌細(xì)胞團(tuán),不同Ebs或同一EB中不同部位的心肌合胞體,其形態(tài)和收縮節(jié)律不盡相同。第13d各組Ebs的分化率分別為丹參組80.21％,丹參素組71.52％,丹參酮ⅡA組65.97％,丹酚酸B組61.46％,與對(duì)照組(58.33％)比較均有顯著性差異。
　　 2、流式細(xì)胞分析各組分離于Ebs的單細(xì)胞中,以丹

13、參組的心肌特異性肌鈣蛋白T陽(yáng)性(cTnT+)細(xì)胞數(shù)所占百分比最高,達(dá)56.23‰,與對(duì)照組(28.47‰)相比,提高心肌細(xì)胞分化率達(dá)198±58％。丹參素組、丹參酮ⅡA組、丹酚酸B組的心肌細(xì)胞分化率分別為51.33‰、45.00‰和34.13‰,與對(duì)照組相比提高心肌細(xì)胞分化達(dá)180±25％、158±34％和120±60％。
　　 3、免疫熒光檢測(cè)各組分化培養(yǎng)13d的Ebs經(jīng)α-actinin染色呈陽(yáng)性,同時(shí),cardiac tr

14、oponinⅠ的表達(dá),在從第13d各組Ebs中分離出的分化心肌細(xì)胞內(nèi)也能被觀察到。
　　 4、誘導(dǎo)劑量的各組藥物對(duì)ESCs細(xì)胞周期和細(xì)胞增殖的影響流式細(xì)胞分析顯示,對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的ESCs大部分處于S期,誘導(dǎo)劑量的各組藥物對(duì)細(xì)胞周期無顯著影響,且不誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的產(chǎn)生。MTT法結(jié)果顯示,丹參素組、丹參酮ⅡA組、丹酚酸B組所測(cè)OD值與對(duì)照組比較有顯著性差異,即誘導(dǎo)劑量的各組藥物對(duì)ESCs無毒性作用,且丹參素、丹參酮ⅡA和丹酚酸B可促進(jìn)E

15、SCs的增殖。
　　 5、ESCs來源的心肌細(xì)胞的分子生物學(xué)特征在分化培養(yǎng)第12d跳動(dòng)的Ebs中,可見成熟心肌細(xì)胞特征性基因MLC-2v、α-MHC和Anf的表達(dá)。激光共聚焦顯微鏡下,心肌細(xì)胞特征性肌絲結(jié)構(gòu)在ESCs來源的心肌細(xì)胞內(nèi)清晰可見。
　　 結(jié)論:
　　 1、丹參及其單體成分丹參素、丹參酮ⅡA和丹酚酸B均可不同程度地提高ESCs向心肌細(xì)胞的分化率,且丹參的促分化作用顯著高于三種單體成分。
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