維持胚胎干細(xì)胞多能性與誘導(dǎo)定向分化

1、,,干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué),姓名：張鑫學(xué)號：2120161211專業(yè)：病理學(xué)與病理生理學(xué)導(dǎo)師：李宗金,2016.12.15,維持胚胎干細(xì)胞的多能性及誘導(dǎo)定向分化,,ES 細(xì)胞多能性相關(guān)重要信號通路小分子化合物在ES細(xì)胞中的應(yīng)用,,ES 細(xì)胞在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用取決于能否自由操縱 ES 細(xì)胞的命運。 ES 細(xì)胞有許多重要的內(nèi)源轉(zhuǎn)錄因子可以決定其命運，如果不采用基因操作的手段很難控制這些轉(zhuǎn)錄因子的內(nèi)源水平。為此目前研究主要

2、選擇改變體外培養(yǎng)條件來控制 ES細(xì)胞自我更新或者步入分化的命運。所以，鑒定能夠決定 ES 細(xì)胞命運的信號通路以及下游的靶標(biāo)蛋白具有十分重要的意義。,ES 細(xì)胞多能性相關(guān)重要信號通路,NO.1,,,LIF/JAK/STAT3 signaling pathway,體外培養(yǎng)小鼠 ES 細(xì)胞需要和滅活的成纖維細(xì)胞滋養(yǎng)層共培養(yǎng)白血病抑制因子（LIF）撤掉 LIF 致使 ES細(xì)胞迅速分化為中胚層和內(nèi)胚層的混合細(xì)胞群,,,STAT3 下游靶標(biāo)基因

3、 關(guān)鍵多能性因子的有力候選基因,,直接調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子 Myc持續(xù)表達(dá)自我更新不再依賴 LIF,,,,下 游 靶 標(biāo) 包 含 Klf4 ,Pim1/3 ,Prr13,Gbx2,Pramel7,Pem/Rhox5,Jmjd1a 以及 Tfcp2l1,,,過表達(dá)模擬 LIF 的功效,,,分離處于原始多能性狀態(tài)的人類 ES 細(xì)胞，這些細(xì)胞具有較高的 LIF/STAT3 活性，這證明了 LIF/STAT3 是原始多能性的強力標(biāo)

4、志。Tfcp2l1在人類囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中高水平表達(dá)，而從內(nèi)細(xì)胞團(tuán)分離的人 ES 細(xì)胞內(nèi)，Tfcp2l1 的表達(dá)卻顯著下降，而其表達(dá)水平在重建原始多能性的過程中又明顯上調(diào)。敲降Tfcp2l1 的人類多能性干細(xì)胞無法完成向原始多能性的轉(zhuǎn)化。Tfcp2l1 可能是 LIF/STAT3 通路下游建立和維持原始 多能性的重要的效應(yīng)蛋白。,Wnt/β-catenin signaling pathway,基于N2B27 的化學(xué)成分明

5、 確的培養(yǎng)體系糖原合成激酶 3（GSK3）的抑制劑 CHIR99021（CHIR）,,,CHIR 不能維持 β-catenin 敲除的 ES 細(xì)胞自我更新，提示著β-catenin 在這一過程中發(fā)揮關(guān)鍵的作用。,,TGF-β/SMAD signaling pathway,,TGF-β 生 長 因 子 超 家 族 可 以 分 為 兩 個 亞 組 ： TGF-β/Activin/Nodal 通 路 和BMP/Smad/I

6、d 通路。TGF-β 超家族執(zhí)行著進(jìn)化保守的功能，包括胚胎形態(tài)發(fā)生，細(xì)胞命運選擇，細(xì)胞增殖，分化和凋亡。 兩個信號通路分別是被配體結(jié)合穿膜的Ⅰ型和Ⅱ型受體啟動，Ⅰ型受體的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域通過然后絲氨酸/蘇氨酸激酶活性磷酸化 TGF-β 通路的效應(yīng)蛋白——SMAD 蛋白（SMAD1，2，3，5，8）。磷酸化的 SMAD蛋白進(jìn)行同源三聚化并和 SMAD4 形成異源復(fù)合物。激活的 SMAD 復(fù)合物易位進(jìn)入核內(nèi)，識別特定的 DNA

7、序列啟動對靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。TGF-β/Activin/Nodal 通路對上皮樣細(xì)胞-間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)化（EMT）過程至關(guān)重要，EMT 是胚胎發(fā)育的重要標(biāo)志。,,在有血清無滋養(yǎng)層的條件下，BMP 通路可以協(xié)同 LIF/STAT3 通路維持小鼠 ES 細(xì)胞的自我更新。激活的 LIF/STAT3 主要抑制朝向中胚層和內(nèi)胚層的分化，而 BMPs 主要通過 SMAD1/5/8 抑制朝向神經(jīng)系統(tǒng)的分化。,,,NO.2,,小分子化合物在ES細(xì)胞中的應(yīng)

8、用,干細(xì)胞生物學(xué)，尤其是 iPS 技術(shù)的發(fā)展為 ES 細(xì)胞在再生醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用提供了強大的理論基礎(chǔ)，同時也要求研究者們對 ES 細(xì)胞的維持及定向分化有更為深入的了解?，F(xiàn)已證明，靶向特定信號通路或機制的小分子化合物在控制細(xì)胞命運，狀態(tài)和功能方面有重要作用。這些小分子將對闡釋 ES 細(xì)胞生物學(xué)功能和促進(jìn)其在再生醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用發(fā)揮越來越重要的作用。 維持 ES 細(xì)胞多能性，或誘導(dǎo) ES細(xì)胞分化方面的取得一定研究進(jìn)展的小分子化合物—

9、—SC1，CHIR99021，PD0325901，SB431542以及BIO 。,① SC1 能夠在無滋養(yǎng)層，無血清且無 LIF 添加的細(xì)胞培養(yǎng)液中使小鼠 ES 細(xì)胞保持未分化的多能性狀態(tài)。長期添加 SC1 的 ES 細(xì)胞能夠在體外分化為所有三個胚層的細(xì)胞，并且能生成嵌合小鼠。化學(xué)和生物學(xué)的實驗表明SC1 是通過抑制 RsaGAP 和細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶 （ERK1）而發(fā)揮作用的。RasGAP 的抑制能夠增強磷酸肌醇-3-激酶（PI3K）

10、信號從而促進(jìn) ES 細(xì)胞的自我更新，同時 ERK1 的抑制還能夠抑制 ES 細(xì)胞的分化。,②CHIR99021 是糖原合酶激酶-3（GSK3）的特異性抑制劑，該通路的抑制會激活 Wnt 通路，從而促進(jìn)細(xì)胞的自我更新。 ③PD0325901 是絲裂原活化蛋白激酶（MEK）的抑制劑，這一抑制作用阻止了 ES 細(xì)胞的分化。 同時添加這兩種小分子能夠在沒有外源細(xì)胞因子添加的情況下促進(jìn)小鼠ES細(xì)胞的分離和長期的自

11、我更新。,④SB431542 是 TGF-β 受體的抑制劑，在其它細(xì)胞添加劑存在的條件下，Noggin（一個可以結(jié)合并抑制 BMP4 的分泌蛋白）與 SB431542 的加入能夠共同誘導(dǎo)大于 80%的人類 ES 細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化。 這兩個通路抑制劑協(xié)同作用會影響人類 ES 細(xì)胞的自我更新（因為 TGF-β 信號通路是人類 ES 細(xì)胞維持自我更新所必需的），并阻止細(xì)胞分化為滋養(yǎng)外胚層，中胚層和內(nèi)胚層的細(xì)胞。,⑤BIO

12、是 Wnt 通路的激活劑，通過特異性的抑制 GSK-3 來維持人類和小鼠 ES 細(xì)胞的多能性和維持多能性特異性轉(zhuǎn)錄因子 Oct4，Rex-1 和 Nanog 的表達(dá)。 Wnt通路在未分化的小鼠 ES 細(xì)胞中自發(fā)激活并在分化過程中活性下降。同其它小分子一樣，BIO 介導(dǎo)的 Wnt 通路的激活是可逆的，當(dāng)其被撤掉后，ES 細(xì)胞就可以進(jìn)行正常的多向分化。小分子的這些特性也使它們更加有望用于再生醫(yī)學(xué)中。,,除此之外：,干細(xì)胞的

13、定向分化是生物體發(fā)育、生長和修復(fù)的基礎(chǔ),小分子化合物由于其顯著的優(yōu)勢越來越多地被應(yīng)用于體外誘導(dǎo)干細(xì)胞定向分化和疾病的治療。,用視黃酸處理的鼠胚胎干細(xì)胞會分化為神經(jīng)祖細(xì)胞, 再經(jīng)過 Shh 的特異性小分子拮抗劑 Hh -Ag1 .3處理 , 則定向分化為運動神經(jīng)元。 PI3 -K 抑制劑 LY294002 能促使體外培養(yǎng)的胚胎干細(xì)胞分化為分泌胰島素的 β 細(xì)胞。 抗壞血酸能有效地加強胚胎干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化。,

14、骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)在地塞米松、8 -甘油磷酸鈉 、維生素 C 的誘導(dǎo)作用下 , 能夠向成骨細(xì)胞分化 小分子化合物 D609 ，β -巰基乙醇(BME)、二甲基亞砜(DMSO)和丁羥基茴香醚(BHA)等能誘導(dǎo)MSCs 向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化還可以向外胚層的神經(jīng)元細(xì)胞和內(nèi)胚層的肝卵圓性細(xì)胞分化。 由于其來源廣泛取材方便, 以及移植時發(fā)生免疫排斥反應(yīng)的程度較低 ,因而是目前臨床應(yīng)用前景較好的細(xì)胞替代治療的靶