雞原始生殖細胞及軟骨干細胞分離培養(yǎng)與生物學(xué)特性研究.pdf

1、干細胞因具有“無限”增殖和自我更新的特點，利用干細胞保存動物遺傳資源將得到逐步認可與應(yīng)用。但目前家禽干細胞仍存在分離培養(yǎng)效率低、生物學(xué)特性研究尚不明確等問題。因此，本實驗研究了雞原始生殖細胞和軟骨干細胞體外分離方法、體外培養(yǎng)體系及其生物學(xué)特性，實驗結(jié)果如下：
　　1.采用胰酶消化法分離雞原始生殖細胞于雞胚成纖維細胞上培養(yǎng)，細胞呈集落式生長;對純化細胞進行堿性磷酸酶和PAS染色，細胞集落分別呈現(xiàn)藍紫色和紅色陽性表達，并且集落具有形成

2、類胚體能力;對細胞進行核型檢測，含有78條染色體，其中包含10對大染色體和29對微小染色體;對純化細胞進行表面分子標志鑒定，免疫熒光檢測顯示c-Kit、Oct4、SSEA-1、SSEA-3和SSEA-4表達陽性，RT-PCR結(jié)果顯示Kit、Nanog、Sox2、DAZL和POUV均表達陽性。以上結(jié)果顯示，所分離細胞集落為原始生殖細胞。利用成上皮誘導(dǎo)液對雞原始生殖細胞進行誘導(dǎo)分化，誘導(dǎo)后的細胞進行免疫熒光鑒定，CK-18和CK-19上皮標

3、記基因呈陽性表達;利用成肝誘導(dǎo)液對雞原始生殖細胞進行誘導(dǎo)分化，誘導(dǎo)后的細胞進行糖原染色呈陽性，誘導(dǎo)后細胞與肝細胞形態(tài)相符，RT-PCR檢測到肝細胞特異分子標記AFP和ALB;利用成軟骨誘導(dǎo)液對雞原始生殖細胞進行誘導(dǎo)分化，誘導(dǎo)后細胞用阿利新藍染色可見藍色類似軟骨樣細胞團，RT-PCR檢測到軟骨細胞分子標記COL2A1、VIM、SO9和ACAN;利用精子誘導(dǎo)液對雞原始生殖細胞進行誘導(dǎo)分化，誘導(dǎo)后細胞呈精子樣生長。結(jié)果顯示，原始生殖細胞具有多

4、潛能性，可向不同胚層細胞和生殖細胞分化。
　　2.采用鏈蛋白酶和膠原酶Ⅱ連續(xù)消化法分離雞軟骨干細胞，在體外可傳代培養(yǎng)到22代。細胞呈長梭形間充質(zhì)干細胞樣生長，細胞核較大;生長曲線顯示不同代次細胞具有不同的增殖能力;對細胞進行核型鑒定，符合雞核型標準，包含10對可見染色體;對純化細胞進行軟骨干細胞和間充質(zhì)干細胞表面分子標志鑒定，免疫熒光檢測顯示Collgen1、Collgen2、Aggrecan1、Vimentin、Fgfr3和So

5、x9表達陽性，RT-PCR結(jié)果顯示COL2A1、VIM、SOX9和ACAN均表達陽性;利用流式細胞儀，對分離細胞進行陽性率檢測，CD29、CD44、CD166和CD105間充質(zhì)干細胞標記基因陽性表達率均高于98％。以上結(jié)果表明，所分離細胞為軟骨干細胞。利用成脂誘導(dǎo)液對軟骨干細胞進行誘導(dǎo)分化，誘導(dǎo)后的細胞進行油紅O染色，可見紅色脂滴，RT-PCR檢測到脂肪細胞特異性分子標記LPL和PPAR-γ;利用成骨誘導(dǎo)液對軟骨干細胞進行誘導(dǎo)分化，誘導(dǎo)

6、后細胞進行茜素紅染色呈陽性，RT-PCR檢測到成骨細胞特異性分子標記COL1A2和SPP1;利用成軟骨誘導(dǎo)液對軟骨干細胞進行3D培養(yǎng)，誘導(dǎo)后細胞團形態(tài)類似軟骨球，對其進行石蠟切片，并進行阿利新藍和甲苯胺藍染色呈陽性，在對其進行免疫熒光染色，COL1A2和COL2A1均表達陽性。結(jié)果表明，軟骨干細胞為專能干細胞。
　　綜上所述，本實驗在體外成功分離了雞原始生殖細胞和雞軟骨干細胞，并對其生物學(xué)特性進行了研究，對雞多潛能干細胞和專能干細