北京油雞骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和胚胎生殖細(xì)胞重要生物學(xué)特性研究.pdf

1、本試驗(yàn)對(duì)北京油雞胚胎生殖細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、生物學(xué)特性鑒定、外源基因?qū)爰罢T導(dǎo)分化進(jìn)行了初步探索和研究,得出了以下結(jié)果:1.采用全血貼壁或密度梯度離心法分離30～60日齡雞脛骨的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,經(jīng)篩選、擴(kuò)增,在體外培養(yǎng)傳至第7代. 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為貼壁生長(zhǎng),形態(tài)大多為紡錘形,少量多角形、圓形.細(xì)胞生長(zhǎng)曲線呈"S"型,細(xì)胞群體倍增時(shí)間約36h.本試驗(yàn)共凍存8個(gè)個(gè)體的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,25支凍存管.凍存前、復(fù)蘇后

2、細(xì)胞活率分別為98﹪、87.5﹪.2.北京油雞骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞核型分析統(tǒng)計(jì)結(jié)果二倍體染色體數(shù)目為2n=78±,符合北京油雞的種屬特性,遺傳性能穩(wěn)定;組織化學(xué)檢測(cè)糖原檢測(cè)呈陽(yáng)性、堿性磷酸酶檢測(cè)呈陰性、蘇丹Ⅲ染色呈陰性,符合MSCs的組織化學(xué)特征;免疫熒光檢測(cè)顯示北京油雞MSCs表達(dá)細(xì)胞表面標(biāo)志CD44、CD54、SSEA-4,不表達(dá)CD34、CD45、SSEA-1、c-kit,和其他物種的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相似:微生物檢測(cè)結(jié)果均為陰性.3.

3、脂質(zhì)體介導(dǎo)pEGFP-Cl基因轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,轉(zhuǎn)染后48h～96h陽(yáng)性細(xì)胞明顯增多、強(qiáng)度增強(qiáng),1周內(nèi)有較強(qiáng)表達(dá),轉(zhuǎn)染率最高可達(dá)40﹪.4.體外培養(yǎng)雞骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在地塞米松、β-磷酸甘油、抗壞血酸誘導(dǎo)下,以及與骨組織共培養(yǎng)條件下,分化為成骨細(xì)胞,具有成骨細(xì)胞的形態(tài)特征,堿性磷酸酶活性提高,茜素紅、四環(huán)素標(biāo)記檢測(cè)呈陽(yáng)性.5.分離孵化5.5d雞胚生殖腺中的原始生殖細(xì)胞,原代與生殖腺細(xì)胞共培養(yǎng),繼代采川鼠胚成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層培養(yǎng),獲得的

4、胚胎生殖細(xì)胞克隆體外培養(yǎng)傳至第7代.北京油雞胚胎原始生殖細(xì)胞含大的細(xì)胞核和相對(duì)較少的胞質(zhì),核仁不明顯;胚胎生殖細(xì)胞克隆呈規(guī)則的島狀或其他集落狀生長(zhǎng),多層分布. 本實(shí)驗(yàn)共凍存10個(gè)個(gè)體胚胎生殖細(xì)胞,30支凍存管.凍存前、復(fù)蘇后細(xì)胞活率分別為93.5﹪、74.7﹪.6.北京油雞胚胎生殖細(xì)胞經(jīng)染色體核型分析、細(xì)胞組織化學(xué)鑒定、免疫熒光檢測(cè)、微生物檢測(cè),證明所培養(yǎng)細(xì)胞為胚胎生殖細(xì)胞,符合北京油雞的種屬特性,遺傳性能穩(wěn)定;培養(yǎng)物生長(zhǎng)狀態(tài)良