人胚胎生殖細(xì)胞的原代、傳代培養(yǎng)及生物學(xué)鑒定.pdf

1、目的：鑒定組織塊培養(yǎng)法體外培養(yǎng)人胚胎生殖腺嵴和背側(cè)腸系膜所獲得的細(xì)胞為未分化的人胚胎生殖細(xì)胞(人EG細(xì)胞)；嘗試不同時(shí)間和不同方法對人EG細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，探討最佳傳代時(shí)機(jī)和傳代方法；并確定傳代培養(yǎng)的細(xì)胞仍為未分化的人EG細(xì)胞。 方法：取5～10周人胚胎生殖腺嵴和背側(cè)腸系膜，用源于自身胚胎組織的成纖維細(xì)胞作為飼養(yǎng)層，在不添加任何細(xì)胞因子條件下進(jìn)行組織塊培養(yǎng)。以免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測培養(yǎng)細(xì)胞中SSEA．1、SSEA-3、Oct-4、端

2、粒酶的表達(dá)；利用流式細(xì)胞術(shù)檢測所得細(xì)胞中人EG細(xì)胞的比例。對原代培養(yǎng)第八天和第16天的細(xì)胞采用挑出傳代法、消化傳代法傳代培養(yǎng)，其中消化傳代法使用的三種消化液分別是0．25％胰蛋白酶、0．5％胰蛋白酶和0．25％胰蛋白酶-0．02％EDTA。檢測傳代培養(yǎng)后細(xì)胞中SSEA-1、SSEA-3、Oct-4、端粒酶的表達(dá)。 結(jié)果：原代培養(yǎng)的細(xì)胞生長良好，免疫細(xì)胞化學(xué)檢測顯示，位于飼養(yǎng)層上的細(xì)胞及細(xì)胞集落陽性表達(dá)SSEA-1、SSEA-3、

3、Oct-4、端粒酶；流式細(xì)胞術(shù)檢測表明，培養(yǎng)體系中人EG細(xì)胞比例約為13％。原代培養(yǎng)至第八天時(shí)，細(xì)胞生長最旺盛，適合于傳代；第16天時(shí)，很多人EG細(xì)胞集落已分化或消散，喪失了傳代的能力。使用胰蛋白酶-EDTA作為消化液消化傳代人EG細(xì)胞所得的集落最多，效果最佳。通過免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測表明，傳代培養(yǎng)第五代細(xì)胞仍保持SSEA．1、SSEA-3、Oct-4、端粒酶的陽性表達(dá)。 結(jié)論：組織塊培養(yǎng)法原代培養(yǎng)人胚胎生殖腺嵴和背側(cè)腸系膜所獲