人胚胎生殖細胞的原代、傳代培養(yǎng)及生物學(xué)鑒定.pdf

1、目的：鑒定組織塊培養(yǎng)法體外培養(yǎng)人胚胎生殖腺嵴和背側(cè)腸系膜所獲得的細胞為未分化的人胚胎生殖細胞(人EG細胞)；嘗試不同時間和不同方法對人EG細胞進行傳代培養(yǎng)，探討最佳傳代時機和傳代方法；并確定傳代培養(yǎng)的細胞仍為未分化的人EG細胞。 方法：取5～10周人胚胎生殖腺嵴和背側(cè)腸系膜，用源于自身胚胎組織的成纖維細胞作為飼養(yǎng)層，在不添加任何細胞因子條件下進行組織塊培養(yǎng)。以免疫細胞化學(xué)法檢測培養(yǎng)細胞中SSEA．1、SSEA-3、Oct-4、端

2、粒酶的表達；利用流式細胞術(shù)檢測所得細胞中人EG細胞的比例。對原代培養(yǎng)第八天和第16天的細胞采用挑出傳代法、消化傳代法傳代培養(yǎng)，其中消化傳代法使用的三種消化液分別是0．25％胰蛋白酶、0．5％胰蛋白酶和0．25％胰蛋白酶-0．02％EDTA。檢測傳代培養(yǎng)后細胞中SSEA-1、SSEA-3、Oct-4、端粒酶的表達。 結(jié)果：原代培養(yǎng)的細胞生長良好，免疫細胞化學(xué)檢測顯示，位于飼養(yǎng)層上的細胞及細胞集落陽性表達SSEA-1、SSEA-3、

3、Oct-4、端粒酶；流式細胞術(shù)檢測表明，培養(yǎng)體系中人EG細胞比例約為13％。原代培養(yǎng)至第八天時，細胞生長最旺盛，適合于傳代；第16天時，很多人EG細胞集落已分化或消散，喪失了傳代的能力。使用胰蛋白酶-EDTA作為消化液消化傳代人EG細胞所得的集落最多，效果最佳。通過免疫細胞化學(xué)方法檢測表明，傳代培養(yǎng)第五代細胞仍保持SSEA．1、SSEA-3、Oct-4、端粒酶的陽性表達。 結(jié)論：組織塊培養(yǎng)法原代培養(yǎng)人胚胎生殖腺嵴和背側(cè)腸系膜所獲