人胚胎生殖細(xì)胞自我更新及分化的機(jī)制研究.pdf

1、研究背景: 1998年美國科學(xué)家先后從囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(inner cell mass，ICM)及原始生殖細(xì)胞(primordial germ cells，PGCs)中分離得到人 ES細(xì)胞系(embryonic stem cells)和人EG細(xì)胞(embryonic germ cells)。它們在體外具有的無限增殖和多向分化能力使其成為胚胎早期發(fā)育研究、細(xì)胞治療和組織工程等領(lǐng)域的重要工具。因此，明確其自我更新和多向分化的調(diào)控機(jī)制是胚

2、胎干細(xì)胞廣泛應(yīng)用的前提。 PGCs 是指在進(jìn)入與體細(xì)胞有密切接觸的生殖腺成為真正的生殖細(xì)胞之前，短暫存在于胚胎的雙倍體生殖細(xì)胞前體。從系統(tǒng)發(fā)育學(xué)的觀點(diǎn)來說，生殖細(xì)胞是至關(guān)重要的，因?yàn)樗休d著遺傳信息，并使之代代相傳，而體細(xì)胞則為生殖細(xì)胞提供保護(hù)和營養(yǎng)。因而，只有了解生殖系從PGCs到成熟配子的發(fā)育過程才能洞悉人類胚胎發(fā)生的起源。從干細(xì)胞生物學(xué)的角度而言，原始生殖細(xì)胞是成熟配子的前體，將其看作干細(xì)胞是無可爭議的。 hEG

3、細(xì)胞培養(yǎng)的困難相對(duì)較大。1998 年至今僅少數(shù)幾個(gè)實(shí)驗(yàn)室宣布獲得了 hEG 細(xì)胞，且至今尚未獲得可長期培養(yǎng)的 hEG 細(xì)胞，因此優(yōu)化 hEG 細(xì)胞培養(yǎng)體系必將推動(dòng)其深入研究。hEG 細(xì)胞的基本培養(yǎng)基中需添加多種細(xì)胞因子以維持其在未分化狀態(tài)下的增殖，包括白血病抑制因子(Leukemia inhibitory factor，LIF)、干細(xì)胞生長因子(Stem cell factor，SCF)、成纖維細(xì)胞生長因子(Fibroblast gro

4、wth factor，F(xiàn)GF)、 Forskolin 等。同時(shí)，hEG 細(xì)胞的生長還依賴于飼養(yǎng)層細(xì)胞的支持。傳統(tǒng)培養(yǎng)體系中，飼養(yǎng)層主要采用小鼠成纖維細(xì)胞系STO或原代MEF，可能導(dǎo)致培養(yǎng)體系的鼠源性污染?？傊?，hEG 細(xì)胞的深入研究和臨床應(yīng)用的前提是建立安全、有效的培養(yǎng)體系。 本實(shí)驗(yàn)分離人5-9周流產(chǎn)胚胎生殖嵴，以表達(dá)LIF基因的人胚肺成纖維細(xì)胞(LIF-expressing human embryonic lung fibro

5、blasts，hELF/lif)作為飼養(yǎng)層培養(yǎng)hEGC，并對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行鑒定，旨在為hEG細(xì)胞培養(yǎng)體系的建立和優(yōu)化奠定基礎(chǔ)。自2003年以來，已有實(shí)驗(yàn)室報(bào)道獲得ES細(xì)胞來源的生殖細(xì)胞。2004年底，Science期刊將“體外系統(tǒng)中ES細(xì)胞分化產(chǎn)生生殖細(xì)胞”的發(fā)現(xiàn)列為該年的十大突破進(jìn)展之一。由胚胎干細(xì)胞分化為生殖細(xì)胞，除為生殖系統(tǒng)發(fā)育提供可研究的模型外，無疑還將為獲得成體生殖細(xì)胞提供很好的材料，因此具有極大的理論和實(shí)際價(jià)值。特別的是，

6、EG細(xì)胞作為生殖系本身來源的多能干細(xì)胞，將其作為向生殖細(xì)胞分化的種子細(xì)胞較ES細(xì)胞更為適合。此外在體內(nèi)發(fā)育過程中，PGCs遷移到生殖嵴，增殖到足夠數(shù)量后，即觸發(fā)減數(shù)分裂，分化為生殖系干細(xì)胞。但是，維持自我更新和觸動(dòng)分化過程中發(fā)揮作用的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，目前仍不清楚。由于原始生殖細(xì)胞缺乏特異性標(biāo)記，同時(shí)受標(biāo)本來源的限制，使得長期以來對(duì)PGCs分化機(jī)制的研究較少。hEG細(xì)胞來源于生殖系統(tǒng)，本實(shí)驗(yàn)將PGCs來源的hEG細(xì)胞進(jìn)行體外“順勢分化”，研

7、究分化過程中多能干細(xì)胞標(biāo)記Oct4、Nanog，生殖系標(biāo)記Stella、VASA，減數(shù)分裂相關(guān)標(biāo)記SCP1、SCP3、GDF9、TEKT1的表達(dá)，探討PGCs曾,殖分化機(jī)制。研究結(jié)果一、以轉(zhuǎn)染 LIF 基因的人胚肺成纖維細(xì)胞為飼養(yǎng)層培養(yǎng)人胚胎生殖細(xì)胞原代來源的人胚肺成纖維細(xì)胞形態(tài)典型，增殖旺盛。LIF 基因真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞經(jīng) G418 篩選后得到可傳代陽性克隆，經(jīng)RT-PCR和western-blot鑒定均能穩(wěn)定表達(dá)LIF。

8、 分離5-9周胚胎生殖嵴細(xì)胞，種植到hELF/lif細(xì)胞制成的飼養(yǎng)層上，在培養(yǎng)基中不添加外源性LIF蛋白的條件下，PGCs 來源的 hEG 細(xì)胞形成典型的鳥巢狀集落，集落呈高度的堿性磷酸酶活性，胚胎特異抗體SSEA-1、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81 陽性。表達(dá)未分化標(biāo)志 Oct-4，Nanog 和 Rex-1，以及端粒酶活性標(biāo)記：hTERT。染色體分析培養(yǎng)25天后的細(xì)胞為正常人染色體核型。具有hEG細(xì)胞的形態(tài)學(xué)及

9、生物學(xué)特性。免疫組化和免疫熒光分析發(fā)現(xiàn)：14天EB表達(dá)組織特異性標(biāo)志Desmin 和 AFP。之后分別對(duì)未分化 hEG 細(xì)胞，第 7 天 EB 細(xì)胞和第 14天 EB 細(xì)胞進(jìn)行的 RT-PCR 分析發(fā)現(xiàn)：隨分化程度增加，EB細(xì)胞表達(dá)三個(gè)胚層來源細(xì)胞標(biāo)志，分別為內(nèi)胚層：α-FP，Pdx-1；中胚層：CD34，enolase；外胚層：Vimentin，NF68，表明 hEG 細(xì)胞具有向三個(gè)胚層分化的多向潛能。分別收集在hELF和hELF/l

10、if細(xì)胞上生長7天和10天的hEG細(xì)胞，進(jìn)行RT-PCR分析。hEG細(xì)胞中能檢測到LIFR的表達(dá)，但僅在hELF/lif細(xì)胞上生長的hEG細(xì)胞中檢測到LIF信號(hào)通路靶基因c-myc的表達(dá)，提示在hELF/lif飼養(yǎng)層上生長的hEG細(xì)胞中LIF信號(hào)通路被激活。二、hEG細(xì)胞向生殖細(xì)胞分化及其調(diào)控機(jī)制RT-PCR的方法分析表明：未分化hEG細(xì)胞有較高水平的Oct4和Nanog表達(dá)，而hEG細(xì)胞一旦分化形成為EB (Day3)，Nanog表達(dá)

11、水平立即顯著下降，并隨進(jìn)一步分化下降到檢測不到的水平。而Oct4在hEG細(xì)胞分化后表達(dá)水平下降，但仍保持一定的表達(dá)。生殖系標(biāo)志分子STELLA，PGCs細(xì)胞后期(遷移到生殖嵴，減數(shù)分裂前)階段特異性基因VASA從EB形成第7天被檢測到，表達(dá)水平持續(xù)上升，同時(shí)，卵母細(xì)胞特異性基因GDF9和精原細(xì)胞特異性基因TEKT1分別從EB形成第3天，和EB形成第7天開始被檢測到。減數(shù)分裂標(biāo)志SCPI在EB中也被檢測到。 對(duì)hEG細(xì)胞和EB進(jìn)行

12、免疫熒光分析發(fā)現(xiàn)：未分化hEG細(xì)胞胞漿表達(dá)Nanog，而EB中表達(dá)減數(shù)分裂標(biāo)志分子SCP3啪細(xì)胞的Nanog表達(dá)是缺失的。分別對(duì)第7周胚胎和第13周男性及女性胚胎生殖嵴進(jìn)行檢測，結(jié)果表明：Nanog在PGCs遷移發(fā)育階段(第7周)大量表達(dá)；而PGCs到達(dá)生殖嵴后，男性生殖細(xì)胞停滯在有絲分裂階段，女性生殖細(xì)胞在進(jìn)入減數(shù)分裂(第13周)后Nanog的表達(dá)立即下降到檢測不到的水平。因此，Nanog在抑制胚胎生殖細(xì)胞分化中可能發(fā)揮重要作用。Na

13、nog表達(dá)下調(diào)是體內(nèi)觸動(dòng)生殖細(xì)胞減數(shù)分裂的必要條件，而體外受Oct4轉(zhuǎn)錄調(diào)控的Nanog表達(dá)水平下降可能是促進(jìn)hEG細(xì)胞分化的直接原因。上述結(jié)果顯示本培養(yǎng)體系中的hEG細(xì)胞具有向生殖細(xì)胞分化的能力，并具有減數(shù)分裂的潛能。結(jié)論原始生殖細(xì)胞是成體生殖細(xì)胞的前體，而成體配子融合又將形成受精卵，從而啟動(dòng)胚胎發(fā)育全過程，因此 PGCs 攜帶遺傳信息起著傳承生命的作用，在胚胎發(fā)育中具有至關(guān)重要的地位，同時(shí)又作為體外培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞的來源之一，具有臨床

14、應(yīng)用的巨大潛力。國內(nèi)外科研工作者圍繞維持 PGCs 未分化狀態(tài)及多能性的分子調(diào)節(jié)機(jī)制作了大量研究，但具體機(jī)制仍不清楚。進(jìn)一步探討 hEG 細(xì)胞自我更新及分化過程中關(guān)鍵因子的功能，具有發(fā)育生物學(xué)和干細(xì)胞治療學(xué)的雙重意義。 建立無異種動(dòng)物成分污染的培養(yǎng)系統(tǒng)是胚胎干細(xì)胞技術(shù)發(fā)展的必然趨勢。本研究將LIF基因轉(zhuǎn)入hELF細(xì)胞中，建立人來源的能分泌LIF活性蛋白的新的飼養(yǎng)層來支持人hEG細(xì)胞的體外生長。為優(yōu)化hEG細(xì)胞培養(yǎng)體系奠定基礎(chǔ)。在

15、此過程中獲得人LIF基因真核表達(dá)載體、穩(wěn)定表達(dá)LIF的人胚肺成纖維細(xì)胞等材料也可成為多功能細(xì)胞因子LIF功能的研究工具。 本實(shí)驗(yàn)關(guān)于hEG細(xì)胞向生殖細(xì)胞分化過程中分子表達(dá)變化的研究，為人類生殖系統(tǒng)發(fā)育這一長期困擾生物界的難題提供了線索，也為重要轉(zhuǎn)錄因子在胚胎干細(xì)胞自我更新中的作用研究提供了證據(jù)。在本研究前期建立的以hELF/lif飼養(yǎng)層為基礎(chǔ)的hEG細(xì)胞培養(yǎng)體系中生長的hEG細(xì)胞，分化形成EB，表達(dá)生殖細(xì)胞和減數(shù)分裂標(biāo)志分子，具