人胚胎生殖細(xì)胞向心肌細(xì)胞誘導(dǎo)分化及蛋白質(zhì)組學(xué)分析.pdf

1、目的:
　　 1.利用抗壞血酸誘導(dǎo)人胚胎生殖細(xì)胞(human embryonic germ cells，hEGC，人EG細(xì)胞)向心肌細(xì)胞分化;
　　 2.利用半定量RT-PCR的方法鑒定人EG細(xì)胞和誘導(dǎo)后心肌細(xì)胞表達(dá)GATA-4和ACTC1等基因的情況;3.結(jié)合生物信息學(xué)的方法推斷分化過(guò)程中相關(guān)蛋白的相互作用關(guān)系。
　　 方法：
　　 取5-10周人胚胎生殖腺嵴，以同源人胚胎成纖維細(xì)胞為飼養(yǎng)層，組織塊培養(yǎng)

2、法原代培養(yǎng)人EG細(xì)胞。將生長(zhǎng)良好的人EG細(xì)胞，接種于細(xì)菌培養(yǎng)皿中進(jìn)行懸滴、懸浮培養(yǎng)，7天后將形成的擬胚體置于明膠包被的24孔培養(yǎng)板中，加入含0.1mg/ml抗壞血酸的誘導(dǎo)液進(jìn)行誘導(dǎo)分化培養(yǎng)，免疫熒光法檢測(cè)誘導(dǎo)2周后細(xì)胞心肌連接蛋白Cx43的表達(dá);通過(guò)CCK-8法測(cè)定誘導(dǎo)后心肌細(xì)胞增殖率。設(shè)實(shí)驗(yàn)組（誘導(dǎo)后的心肌細(xì)胞）和對(duì)照組（未經(jīng)誘導(dǎo)的人EG細(xì)胞），提取各組細(xì)胞的RNA，用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)所提 RNA的質(zhì)量與濃度，并進(jìn)行GATA-4、A

3、CTC1、nkx2.5、KRIT1、Anxa2、VDAC1及CSRP3的RT-PCR反應(yīng)，取8μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像儀保存圖像。通過(guò)“NCBI”等相關(guān)網(wǎng)站研究不同組細(xì)胞之間差異蛋白的空間結(jié)構(gòu)，及其相互作用關(guān)系。
　　 結(jié)果:
　　 組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)的人EG細(xì)胞增殖旺盛，其集落呈典型的“鳥(niǎo)巢”狀。人EG細(xì)胞經(jīng)抗壞血酸誘導(dǎo)2周后，陽(yáng)性表達(dá)Cx43，細(xì)胞形態(tài)多為梭形，并且分化的細(xì)胞不斷增殖。半定量RT

4、-PCR結(jié)果顯示，由人EG細(xì)胞分化的心肌細(xì)胞表達(dá)心肌特異基因GATA-4、ACTC1、Nkx2.5;而各組細(xì)胞中均檢測(cè)到KRIT1、Anxa2等非心肌特異基因的表達(dá)，只是表達(dá)強(qiáng)度有所不同，且符合質(zhì)譜分析結(jié)果。GATA-4、Nkx2.5與各類(lèi)心肌肌鈣蛋白有著密切的聯(lián)系。
　　 結(jié)論:
　　 人EG細(xì)胞在抗壞血酸的誘導(dǎo)下可分化為心肌細(xì)胞。通過(guò)篩選經(jīng)質(zhì)譜分析得到差異蛋白質(zhì)中與分化相關(guān)的重要蛋白，研究其結(jié)構(gòu)與功能，可為探討人EG