誘導(dǎo)C57小鼠CFs源iPS細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化的實驗研究.pdf

1、目的：模擬心肌微環(huán)境，促小鼠心臟成纖維細(xì)胞(Cardiac fibroblasts, CFs)源的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cell， iPS)向心肌細(xì)胞(cardiomyocyte, CM)分化，為在體原位利用梗死區(qū)CFs修復(fù)梗死心肌，補(bǔ)充具有完全功能的心肌細(xì)胞，提供實驗依據(jù)。
　　 方法：1、分離培養(yǎng)心肌細(xì)胞；2、采用EB球分化的方法，根據(jù)不同的定向分化誘導(dǎo)條件，將CFs來源的iPS細(xì)

2、胞分為陰性對照、自發(fā)分化組、BMP2誘導(dǎo)組和心肌細(xì)胞Transwell共培養(yǎng)組，以自發(fā)分化的ES細(xì)胞和未誘導(dǎo)分化的iPS細(xì)胞為對照，檢測CFs源iPS細(xì)胞的心肌分化能力。對心肌細(xì)胞進(jìn)行以下鑒定：(1)跳動EB的觀察計數(shù)；(2)Realtime-PCR檢測心肌發(fā)育重要轉(zhuǎn)錄因子、肌結(jié)構(gòu)基因(Nkx2.5、GATA4,TBX5,α-Actin、cTnI、α-MHC)及重要多能性因子(Oct4、Nanog、Isl1)的核酸水平表達(dá)；(3)免疫熒

3、光染色檢測心肌Marker的蛋白表達(dá)；(4)通過膜片鉗等電生理技術(shù)檢測心肌動作電位，驗證所得細(xì)胞的自律性。
　　 結(jié)果：1、在體外采用Transwell共培養(yǎng)體系模擬了“心肌”微環(huán)境的旁分泌作用。2、心肌細(xì)胞的定向分化和鑒定：(1)CFs源的iPS細(xì)胞可形成自發(fā)搏動的擬胚體球；在分化14天時，采用心肌共培養(yǎng)誘導(dǎo)條件和BMP2刺激條件的iPS細(xì)胞分化出的跳動EB明顯較自發(fā)分化的iPS細(xì)胞和ES細(xì)胞為多（P＜0.01）。(2)與BM

4、P2誘導(dǎo)和單純的EB自發(fā)分化相比，采用心肌細(xì)胞共培養(yǎng)方法，所得細(xì)胞心肌發(fā)育重要轉(zhuǎn)錄因子、肌結(jié)構(gòu)基因(Nkx2.5,GATA4,TBX5,α-Actin,cTnI,α-MHC)mRNA均表達(dá)較高(P＜0.01)，而全能性因子Oct4和Nanog表達(dá)較低（P＜0.01）。(3)CFs源的iPS誘導(dǎo)定向分化的EB可見cTnl和CX43免疫熒光陽性的細(xì)胞表達(dá)，消化為單細(xì)胞后熒光免疫雙標(biāo)染色可見Nkx2.5和cTnI均為陽性。(4)CFs源的iP