原始生殖細(xì)胞和羊水干細(xì)胞培養(yǎng)及生物學(xué)特性研究.pdf

1、本研究成功建立了雞胚原始生殖細(xì)胞(Primordial Germ Cells，PGCs)的體外培養(yǎng)體系，并對其生物學(xué)特性進(jìn)行鑒定。探討了雞胚PGCs減數(shù)分裂過程及精子發(fā)生相關(guān)基因表達(dá)量的變化。分離培養(yǎng)8w綿羊的羊水干細(xì)胞(Amniotic Fluid Stem Cells，AFSCs)并鑒定其生物學(xué)特性，為AFSCs應(yīng)用于組織工程學(xué)及細(xì)胞移植治療提供理論依據(jù)。研究發(fā)現(xiàn):
　　1使用在孵化箱中孵化5.5 d的雞胚進(jìn)行PGCs的分離。

2、在體視顯微鏡下小心剝離出雞胚兩側(cè)性腺，剪碎后使用0.125％胰蛋白酶+0.02％ EDTA吹打消化，然后接種在培養(yǎng)皿中使用H-DMEM培養(yǎng)，并添加10％胎牛血清(Fetal Bovine Serum，F(xiàn)BS)，1 mM丙酮酸鈉，1％ GlutaMAX，5 ng/mLSCF，5 ng/mL LIF，10 ng/mL bFGF，10 ng/mL IGF等因子促進(jìn)PGCs的增殖及抑制分化。培養(yǎng)24 h后，可在顯微鏡下觀察到PGCs克隆團(tuán)的出現(xiàn)

3、，此時(shí)的飼養(yǎng)層為雞胚性腺基質(zhì)細(xì)胞。48 h后顯微鏡下觀察到PGCs克隆團(tuán)數(shù)量增多，體積變大，呈典型的鋪路石樣。繼代培養(yǎng)時(shí)使用雞胚成纖維細(xì)胞(Chicken Embryo Fibroblast，CEF)飼養(yǎng)層。無論是CEF飼養(yǎng)層還是雞胚性腺基質(zhì)細(xì)胞都能夠PGCs保持穩(wěn)定的未分化狀態(tài)。在本研究中PGCs可在體外連續(xù)培養(yǎng)2個(gè)月，經(jīng)AKP和PAS染色鑒定為陽性;形態(tài)上PGCs較一般細(xì)胞大，折光性強(qiáng);RT-PCR、免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定(immunoc

4、ytochemistry)和流式細(xì)胞分析(Flow Cytometry, FCM)結(jié)果顯示， PGCs對生殖細(xì)胞及胚胎干細(xì)胞(Embryonic Stem Cell，ESCs)的特異性標(biāo)志物呈現(xiàn)陽性反應(yīng)。
　　2雞胚PGCs在骨形態(tài)發(fā)生蛋白(Bone Morphogenetic Proteins，BMPs)、激活素A(Activin A)和維甲酸(Retinoic Acid，RA)的作用下可啟動(dòng)減數(shù)分裂過程，進(jìn)而在(Bovine

5、Pituitary Extract，BPE)、(Follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH)和睪酮(Testosterone，T)的促進(jìn)下誘導(dǎo)生成精子。從qPCR結(jié)果可證明這些激素促進(jìn)了PGCs向精子的分化。
　　3在無菌狀態(tài)下使用注射器抽取8w綿羊胚胎羊水10 mL，并以1500 rpm的速度離心15 min使細(xì)胞富集于離心管底部，最終將細(xì)胞接種至12孔板中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)基選擇DMEM/F12添加10 ng

6、/mL bFGF。羊水中含有多種細(xì)胞類型，不同類型的細(xì)胞形態(tài)也不盡相同。傳代時(shí)選擇長梭形細(xì)胞占多數(shù)的那一孔進(jìn)行傳代操作。消化條件為0.25％胰蛋白酶+0.02％ EDTA于37.5℃培養(yǎng)箱中消化1 min。在經(jīng)過數(shù)次傳代細(xì)胞純度較高時(shí)，對AFSCs的生物學(xué)特性進(jìn)行鑒定。RT-PCR及免疫細(xì)胞化學(xué)檢測結(jié)果顯示AFSCs既表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記物又表達(dá)胚胎干細(xì)胞特異性標(biāo)志物。生長曲線實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示AFSCs的增長呈現(xiàn)典型的S型。核型分析結(jié)果