鵪鶉原始生殖細胞系的建立及鑒定.pdf

1、原始生殖細胞(Primordial germ cells，簡稱PGCs)是精子或卵子的前體細胞，PGCs細胞具有發(fā)育的全能性，任何一個細胞都具有發(fā)育成一個完整個體的潛能，在體外PGCs可誘導(dǎo)分化出包括三個胚層在內(nèi)的所有分化細胞，PGCs也具有種系傳遞功能，能與另一個正常胚胎嵌合，獲得包括生殖系在內(nèi)的動物個體。本研究采用鵪鶉為研究對象，以雞成纖維細胞飼養(yǎng)層及各種生長因子為基礎(chǔ)，對5.5天鵪鶉胚胎PGCs的分離、純化、培養(yǎng)進行了研究，并對鵪

2、鶉的PGCs的冷凍保存效果進行了探討。 1．雞成纖維細胞飼養(yǎng)層的制作：采用孵化6天的海蘭白種雞蛋為實驗材料，經(jīng)培養(yǎng)傳至2-3代后，以絲裂霉素-C處理后所得到的細胞單層作為飼養(yǎng)層。 2．PGCs的分離及鑒定：本實驗采用孵化5.5天的鵪鶉胚胎，以酶解法消化獲得細胞。對其消化時間做了探討，發(fā)現(xiàn)消化15分鐘所獲得的細胞數(shù)最多。每枚性腺獲得的細胞平均為226個左右，并分別用形態(tài)學和堿性磷酸酶(.AKP)對PGCs做了鑒定。

3、 3．PGCs的傳代及培養(yǎng)：分別在無飼養(yǎng)層，無生長因子的培養(yǎng)液中、雞成纖維飼養(yǎng)層及添加LIF\SCF\bFGF的雞成纖維飼養(yǎng)層上對PGCs進行培養(yǎng)。在不含飼養(yǎng)層和生長因子的飼養(yǎng)層中培養(yǎng)原始生殖細胞，基質(zhì)細胞成纖維狀貼壁生長，培養(yǎng)的時間很短，不超過5-6天。原始生殖細胞置放在雞胚成纖維細胞飼養(yǎng)成上時，細胞的分化得到了有效的抑制，前2天原始生殖細胞仍保持單個的未分化狀態(tài)。在培養(yǎng)3天后分化的程度比之無飼養(yǎng)層的PGCs情況好，PGCs存活50％

4、左右。在添加生長因子的成纖維細胞飼養(yǎng)層中培養(yǎng)，前3天左右細胞基本不出現(xiàn)分化，保持單個的未分化狀態(tài)，在4-5天后細胞開始出現(xiàn)分化，PGCs存活76％左右，培養(yǎng)至第6-7天后，細胞出現(xiàn)7-8個細胞的細胞克隆；培養(yǎng)至第10天時，細胞團細胞達到13-15個左右，此時細胞形態(tài)不明顯，細胞間的結(jié)合不緊密，成纖維細胞大量死亡。本實驗嘗試在第7天進行鵪鶉原始生殖細胞的傳代，對于鵪鶉PGCs的傳至第5代，細胞仍具有原始生殖細胞的形態(tài)，部分細胞保持分裂增殖

5、能力。 4．PGCs的冷凍與解凍：解凍保存了2個月的原始生殖細胞。方法1(DMSO作為冷凍液)解凍后細胞存活率為61.4％，方法2(EG+PVP作為冷凍液)解凍后細胞存活率為54.2％(P>0.05)。 以上結(jié)果表明：以酶解法在5.5天鵪鶉性腺中分離到PGCs，將PGCs在添加生長因子的雞成纖維細胞上培養(yǎng)，在第7天對鵪鶉PGCs進行傳代，傳至5代仍有部分細胞存活并具有分裂增殖的潛能。解凍保存2個月的鵪鵓PGCs，獲得了較