無精癥患者誘導(dǎo)多能干細(xì)胞系的建立及其在體外分化成原始生殖樣細(xì)胞的研究.pdf

1、第一部分：建立無精癥患者誘導(dǎo)多能干細(xì)胞系
　　目的：
　　建立無精癥患者誘導(dǎo)多能干細(xì)胞系，為進(jìn)一步研究該疾病的發(fā)病機(jī)制和治療提供合適的細(xì)胞模型。
　　方法：
　　利用仙臺病毒非基因整合的方法，我們建立了無精癥患者外周血單個核細(xì)胞來源的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞系。采用無血清完全培養(yǎng)基（TeSR2）和胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基（Stem Adhere Defined Matrix）限定培養(yǎng)體系進(jìn)行培養(yǎng)，應(yīng)用免疫熒光染色、染色體核型分析、

2、擬胚體和畸胎瘤實驗對iPSCs系的干性、多能性、體內(nèi)外分化能力進(jìn)行驗證。
　　結(jié)果：
　　我們建立了具有人胚胎干細(xì)胞特征的無精癥患者來源的iPSCs系。免疫熒光染色顯示，這些細(xì)胞均表達(dá)SOX2和 OCT4以及TRA-1-60和SSEA-4干細(xì)胞多能性基因；染色體核型分析顯示正常的核型；擬胚體和畸胎瘤實驗表明其在體內(nèi)、體外具有向三個胚層分化的能力。
　　結(jié)論：
　　利用非基因整合方法成功構(gòu)建了無精癥患者外周血來源的

3、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞系，為無精癥發(fā)病機(jī)制的研究及治療提供了細(xì)胞模型。
　　第二部分：無精癥患者iPSCs在體外分化成原始生殖樣細(xì)胞的研究
　　目的：
　　將建立的無精癥患者誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（Patients with azoospermia induce pluripotent stem cells，pa-iPSCs）在體外定向誘導(dǎo)分化為原始生殖樣細(xì)胞（primordial germ cell-like cells,PGCLC

4、s）。
　　方法：
　　我們利用“4i”(PD0325901+CHIR99021+SB203580+SP600125)的培養(yǎng)體系將無精癥患者來源iPSCs轉(zhuǎn)化成naive iPSCs，然后將naive iPSCs在體外在含有bFGF、TGF-β1和1％KSR的預(yù)誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)2天，然后以2000-4000個細(xì)胞/孔傳到低吸附的96孔板中，細(xì)胞培養(yǎng)在含BMP4、LIF、SCF、EGF、和ROCK inhibitor PGCL

5、Cs的分化培養(yǎng)基中。并用免疫熒光染色的方法對PGCLCs進(jìn)行了特異標(biāo)記鑒定。
　　結(jié)果:
　　我們成功將iPSCs轉(zhuǎn)變成了nave態(tài)iPS細(xì)胞，然后在體外成功誘導(dǎo)出PGCLCs，免疫熒光染色顯示PGCLCs表達(dá)PGC的特異標(biāo)記OCT4，SOX17。
　　結(jié)論：
　　通過“4i”體系將pa-iPSCs轉(zhuǎn)變成naive狀態(tài)的干細(xì)胞，并將其在體外誘導(dǎo)分化成了PGCLCs，PGCLCs表達(dá)PGC的特異標(biāo)記SOX17和OC