21三體綜合征誘導(dǎo)多能干細(xì)胞系的建立及誘導(dǎo)神經(jīng)分化的研究.pdf

1、背景：21三體綜合征又稱為唐氏綜合征（Down’s syndrome,DS）或先天愚型，是常見的由常染色體變異導(dǎo)致中至重度智力障礙等多種臨床表現(xiàn)的疾病。在我國該病的發(fā)生率占出生人數(shù)的1/600～1/800，占受孕人數(shù)的1/150。由于該病的基因表達(dá)的復(fù)雜性、表型的多樣性以及個(gè)體間的差異，使該疾病的發(fā)病機(jī)制一直未能被完全解釋。誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells or iPSCs）是一類將特定轉(zhuǎn)錄因

2、子導(dǎo)入分化成熟的體細(xì)胞后使其發(fā)生重編程而形成的具有多能性的干細(xì)胞。特異疾病的iPSCs研究很大程度地保留了成體細(xì)胞基因組的遺傳信息，并且iPSCs能通過細(xì)胞分裂維持細(xì)胞數(shù)量，為疾病的研究提供了真實(shí)的體外細(xì)胞模型并解決了疾病研究的細(xì)胞供源問題。iPSCs同時(shí)具有向各類型組織細(xì)胞分化的潛能，其分化為特定的靶細(xì)胞可為特異疾病發(fā)病機(jī)制的研究提供標(biāo)本和完整的發(fā)育模型，為研究DS等染色體疾病提供了一種新的有利的工具。
　　目的：建立羊水細(xì)胞及

3、皮膚成纖維細(xì)胞來源的21三體誘導(dǎo)多能干細(xì)胞系（Trisomy21 human amniotic fluid induced pluripotent stem cells,T21 hAF-iPSCs and Trisomy21 human dermal fibroblasts induced pluripotent stem cells,T21 hDF-iPSCs），比較兩種細(xì)胞來源的建系效率，為疾病的機(jī)制研究提供理想細(xì)胞模型，同時(shí)研究2

4、1三體綜合征誘導(dǎo)多能干細(xì)胞從全能性細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)分化的過程。
　　方法：⑴利用慢病毒介導(dǎo)4種轉(zhuǎn)錄因子（Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc）分別誘導(dǎo)建立了羊水細(xì)胞及患兒皮膚成纖維細(xì)胞來源的21三體綜合征誘導(dǎo)多能干細(xì)胞系，并通過堿性磷酸酶染色、免疫熒光染色、qPCR檢測基因表達(dá)等方法鑒定其多能性。⑵利用EB懸浮培養(yǎng)法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行體外分化，用PCR檢測各胚層特有基因的表達(dá)情況，并各取1×107個(gè)T21-iPSCs注射到SCID小

5、鼠皮下，6周后得到畸胎瘤，行HE染色，觀察iPSCs在體內(nèi)的分化情況。⑶T21-iPSCs每傳10代重復(fù)一次核型分析，檢測T21-iPSCs遺傳性狀的穩(wěn)定情況。⑷1×105個(gè)感染后的兩種來源細(xì)胞接種在飼養(yǎng)層上，比較出現(xiàn)克隆的時(shí)間長短；在25天進(jìn)行堿性磷酸酶染色，得到出現(xiàn)陽性克隆的效率并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。⑸對(duì)T21-iPSCs及正常人iPSCs利用EB誘導(dǎo)法進(jìn)行體外神經(jīng)干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化，進(jìn)行免疫熒光染色并比較陽性率；獲得神經(jīng)干細(xì)胞后添加特定

6、細(xì)胞因子進(jìn)一步誘導(dǎo)其向神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞及少突膠質(zhì)細(xì)胞分化，進(jìn)行免疫熒光染色并通過特異蛋白陽性表達(dá)來比較分化效率。
　　結(jié)果：①分別建立了羊水細(xì)胞及皮膚成纖維細(xì)胞來源的21三體綜合征的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞系，通過免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)胚胎干細(xì)胞特異性表面抗原Oct4、Nanog、TRA-1-60、SSEA-4染色陽性；qPCR檢測的T21-iPSCs內(nèi)源性多能性基因Nanog、Oct4已被激活，與正常人ES細(xì)胞表達(dá)水平相似；在持續(xù)傳代過程中

7、細(xì)胞形態(tài)學(xué)表現(xiàn)穩(wěn)定，核型檢測發(fā)現(xiàn)T21-iPSCs在傳代過程中能維持異常核型；畸胎瘤實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)T21-iPSCs形成的畸胎瘤可分化為三個(gè)胚層。②約1×105個(gè)感染后的兩種類型細(xì)胞接種在飼養(yǎng)層上，羊水細(xì)胞在5-7天時(shí)出現(xiàn)了胚胎干細(xì)胞樣的克隆，而皮膚成纖維細(xì)胞在13-15天出現(xiàn)克隆。在25天進(jìn)行堿性磷酸酶染色，羊水細(xì)胞來源的得到285個(gè)陽性克隆，效率為0.285％。皮膚成纖維細(xì)胞得到27個(gè)克隆，效率為0.027%。經(jīng)X2檢驗(yàn)P<0.05，誘導(dǎo)

8、羊水細(xì)胞與皮膚成纖維細(xì)胞形成多能性干細(xì)胞的效率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。③對(duì)T21-iPSCs進(jìn)行神經(jīng)誘導(dǎo)分化，T21-iPSCs與正常人iPSCs體外分化神經(jīng)干細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示Nestin、Pax6呈陽性，比較誘導(dǎo)效率無顯著差異。繼續(xù)將神經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為三種神經(jīng)細(xì)胞系，細(xì)胞免疫熒光檢測結(jié)果顯示三種神經(jīng)細(xì)胞系的表面標(biāo)志Tuj1、GFAP和O4的表達(dá)為陽性。在分化成神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的效率方面，T21-iPSCs與對(duì)照組相比無顯著差異。<