人誘導(dǎo)性多潛能干細胞(iPS)系的建立.pdf

1、2006年8月,Yamanaka小組將24種轉(zhuǎn)錄因子基因排列組合導(dǎo)入小鼠成纖維細胞,最終確定最少有4種轉(zhuǎn)錄因子組合-Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4即可將成纖維細胞重編程為誘導(dǎo)性多潛能干(iPS)細胞,2007年11～12月,Yamanaka小組和Thomson小組先后將人的體細胞重編程為iPS細胞。這之后iPS細胞的研究和關(guān)注度呈爆炸式增長,且取得了一些突破性進展,如建立了疾病特異的人iPS細胞、借助轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因方法高效

2、制備了virus-free iPS細胞以及成功地從所獲得的iPS細胞中移除先前導(dǎo)入的轉(zhuǎn)錄因子基因。在利用特定小分子化合物的情況下,更少的外源基因?qū)爰纯筛咝诗@得iPS細胞,這向制備無遺傳修飾的iPS細胞方面邁出了一大步；此外,亦建立了大鼠和猴等的iPS細胞系,這些成績將iPS細胞在臨床上的實際應(yīng)用又大大向前推進了一步,iPS細胞研究和應(yīng)用將有望成為21世紀最偉大的醫(yī)學(xué)生物學(xué)成就之一。
　　 研究腫瘤細胞重編程的經(jīng)典方法有:①利

3、用胚胎微環(huán)境,②囊胚腔注射,③利用胚胎干細胞生長微環(huán)境。iPS細胞技術(shù)的問世為研究腫瘤細胞重編程提供了一種新的思路和手段。利用Oct4、Sox2、C-myc和Klf4即可將腫瘤細胞重編程,2009年7月Hochedlinger課題組用Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4將小鼠黑色素瘤細胞重編程為iPS細胞。iPS技術(shù)為在體外研究腫瘤細胞重編程提供了重要的技術(shù)平臺,為研究腫瘤發(fā)病機制及腫瘤治療等方面提供一種新思路。
　　 本課

4、題借助慢病毒基因投遞法將Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc四種基因?qū)肴似つw成纖維(CCD)細胞,進而將其重編程為iPS細胞,從而實現(xiàn)以下目的:①為體外研究腫瘤細胞重編程構(gòu)筑技術(shù)平臺；②為后續(xù)研究[如iPS細胞生物學(xué)特性和行為(如自我復(fù)制、增殖和分化等)調(diào)控機制研究]奠定基礎(chǔ)。
　　 目的:
　　 借助慢病毒載體法將Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc四種基因?qū)隒CD細胞,進而將其重編程為iPS細胞,以實現(xiàn)多

5、種目的(見上)。
　　 方法:
　　 1)攜帶Oct4、Sox2、C-Myc和Klf4基因的慢病毒載體鑒定
　　 酶切鑒定分別用BamHI/KpnI和EcoR I/EcoR V進行酶切,酶切產(chǎn)物進行1％瓊脂糖凝膠電泳。
　　 PCR鑒定根據(jù)Oct4、Klf4、c-Myc和Sox2序列設(shè)計引物分別擴增Oct4、Klf4、c-Mye和Sox2基因；PCR擴增后,取5μl反應(yīng)液進行2％瓊脂糖凝膠電泳。
　

6、　 2)慢病毒生產(chǎn)與滴度測定
　　 慢病毒包裝按標準程序進行慢病毒包裝(脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染)。
　　 慢病毒滴度測定用5μl病毒上清感染15萬293T細胞,48h后4％多聚甲醛固定,DAPI染色,熒光顯微鏡下計數(shù)EGFP陽性細胞和總細胞數(shù),將其帶入公式:病毒滴度(IU/ml)=EGFP陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù)÷5×1.5×105x103。
　　 3)慢病毒載體法重編程CCD細胞為iPS細胞
　　 a)取一定量

7、的病毒上清過濾后懸浮感染CCD細胞。
　　 b)病毒感染24小時后,將CCD細胞消化鋪于feeder細胞上,換為hES細胞培養(yǎng)基,第十天開始換為條件培養(yǎng)基。
　　 c)20天左右開始挑取克隆,選擇AP陽性細胞繼續(xù)后續(xù)工作。
　　 4)人iPS細胞建系及其生物學(xué)特性鑒定
　　 a)iPS細胞克隆形態(tài)觀察；
　　 b)細胞免疫熒光檢測人ES細胞標志性抗原表達；
　　 c)提取iPS細胞總RNA

8、,進而RT-PCR檢測人ES細胞標志性基因表達；
　　 d)人iPS細胞核型分析；
　　 e)懸浮培養(yǎng)觀察擬胚體形成及體外分化；
　　 f)iPS細胞接種至SCID小鼠皮下,觀察畸胎瘤形成及體內(nèi)分化情況。
　　 結(jié)果:
　　 1)攜帶Oct4、Sox2、C-Myc和Klf4基因的慢病毒載體鑒定
　　 酶切鑒定攜帶Oct4、Sox2、C-Myc和Klf4基因的慢病毒載體分別經(jīng)BamHI/Kp

9、n和EcoR I/EcoR V酶切,酶切產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳均可見兩條預(yù)期大小的條帶。
　　 PCR鑒定分別以攜帶Oct4、Sox2、C-Myc和Klf4基因的慢病毒載體為模板,擴增Oct4、Klf4、c-Myc和Sox2基因,PCR產(chǎn)物大小均與預(yù)期值相符。
　　 2)慢病毒生產(chǎn)與滴度測定
　　 攜帶Oct4、Sox2、C-Mye和Klf4基因的慢病毒載體與病毒包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細胞,24h后倒置熒光顯微

10、鏡下可見綠色熒光,預(yù)示轉(zhuǎn)染成功。按照上述方法進行慢病毒滴度測定,病毒滴度值都在1×106 IU/ml以上。
　　 3)慢病毒載體法重編程CCD細胞為iPS細胞
　　 用攜帶Oct4、Sox2、C-Myc和Klf4基因的慢病毒感染CCD細胞,24h后種植于飼養(yǎng)層(feeder)細胞上,并換為hES細胞培養(yǎng)基,48-72h在倒置熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光,第十天左右開始換為條件培養(yǎng)基。
　　 4)人iPS細胞建系及其

11、生物學(xué)特性鑒定
　　 a)第7-8天可見CCD細胞形態(tài)發(fā)生變化,由長梭形變?yōu)閳A形并聚集；第20天左右挑取克?。?br>　　 b)其中只有1株iPS細胞AP染色呈陽性,且具有典型的hES細胞克隆形態(tài)；
　　 c)1株人iPS細胞系表達hES細胞特有的標志性基因；
　　 d)1株人iPS細胞系表達hES細胞特有的標志性抗原:SSAE-4(+),TRA-1-60(+),TRA-1-81(+),Oct4(+),SSAE

12、-1(-)；
　　 e)1株人iPS細胞核型分析未見異常；
　　 f)1株人iPS細胞系具有體外分化形成囊性擬胚體的能力,并能表達各胚層的標志性基因；
　　 g)畸胎瘤實驗?zāi)壳斑€在進行中。
　　 結(jié)論:
　　 1.運用Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4四種基因成功將CCD細胞重編程為iPS細胞。
　　 2.1株人iPS細胞系具有人ES細胞的一些生物學(xué)特,且在體外長期傳代中能夠維持此特