慢性肝衰患者誘導性多潛能分化干細胞的建立.pdf

1、誘導性多潛能分化干細胞(InducedPluripotentStemCell，iPS)是通過特定的轉錄因子將體細胞重編程為干細胞，從而使其獲得不斷自我更新、增殖及具有多向分化潛能。2006年8月，日本學者Yamanaka研究小組首次利用4種轉錄因子—Oct4，Sox2，c-Myc和Klf4將小鼠胚胎成纖維細胞重編程為iPS細胞;2007年，Yamanaka和Thomson研究小組先后將人的體細胞重編程為iPS細胞。這之后，世界各國對iP

2、S的研究及關注度呈爆炸式增長，且也取得了一些突破性進展，如利用轉基因法制備的無病毒的iPS細胞，建立了疾病特異的人iPS細胞，從所獲得的iPS細胞中移除先前導入的轉錄因子，利用小分子化合物高效獲得iPS細胞等，此外還建立大鼠和猴等iPS細胞系。且iPS細胞不受細胞來源、免疫排斥、倫理、宗教和法律等限制，這些都將使得iPS細胞應用于臨床前進了一大步，iPS細胞研究和應用將有望成為21世紀最偉大的醫(yī)學生物學成就之一。
　　 肝移植可

3、以顯著降低肝衰竭患者病死率，但由于供肝嚴重短缺，事實上僅有不足1/3的患者接受了肝移植手術，而大多數(shù)患者在等待供肝的過程中死亡。基于此種前提下，國內(nèi)外學者設計、構建了不同類型的人工肝系統(tǒng)，為肝衰竭患者肝細胞再生及肝功能恢復創(chuàng)造條件，從而降低患者死亡率。肝細胞是人工肝系統(tǒng)的核心材料，對肝功能衰竭患者的肝支持作用幾乎完全依賴于所用肝細胞的生物學功能，盡管細胞來源種類較多，但目前尚未有一種可以完全滿足臨床的需要。
　　 鑒于iPS細胞

4、是一種類似胚胎干細胞(ES細胞)具有不斷自我更新、不斷增值和具有多向分化潛能的細胞，且又不受細胞來源、免疫排斥、倫理、宗教和法律限制等優(yōu)點，本課題擬借助逆轉錄病毒載體法將Oct4，Sox2，Klf4和c-Myc四種基因導入利用組織塊培養(yǎng)法獲得的慢性肝衰竭患者皮膚成纖維細胞，進而獲得iPS細胞，以實現(xiàn)以下目標:(1)熟練掌握基于逆轉錄病毒載體法將Yamanaka四質粒導入成體細胞使其重編程為iPS細胞這項技術，以為下一步我課題組人工肝系統(tǒng)

5、用于慢性肝衰竭患者治療探尋種子細胞來源提供技術保障;(2)建立人iPS細胞系，為研究其生物學特性及其誘導過程中調(diào)控機制奠定基礎;(3)為人工肝系統(tǒng)探尋新的種子細胞來源。具體包括以下三部分研究內(nèi)容:
　　 一:CF-1小鼠胚胎成纖維細胞飼養(yǎng)層制備
　　 二:逆轉錄病毒制備及鑒定
　　 三:人iPS細胞建立及鑒定
　　 目的:
　　 借助逆轉錄病毒將攜帶Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc四種基因

6、的Yamanaka質粒轉染進入利用組織塊培養(yǎng)法獲得的慢性肝衰患者皮膚成纖維細胞，從而獲得iPS細胞，以實現(xiàn)上述3個目標。
　　 方法:
　　 1.CF-1小鼠胚胎成纖維細胞飼養(yǎng)層制備
　　 孕13.5天CF-1小鼠頸椎脫臼處死，無菌取出胎鼠，用鑷子無菌條件下去除胎鼠的頭、四肢、內(nèi)臟，僅保留軀干。用眼科剪無菌條件下將軀干剪碎并加入等體積混合的0.25％與0.05％胰酶10mL于37℃，5％CO2，95％濕度培養(yǎng)箱中

7、15分鐘，期間每隔3.0-4.0分鐘取出培養(yǎng)皿，用吸管輕輕吹打1.0分鐘。加入等體積的鼠胚胎成纖維細胞(MEF)培養(yǎng)基終止消化，并接種至10cm培養(yǎng)皿中(約每個培養(yǎng)皿接種一個胚胎)，一般傳代培養(yǎng)至第三代，經(jīng)不同質量濃度(5，10，15，20mg/L)的絲裂霉素C處理不同的時間(1，1.5，2，2.5，3小時)制備飼養(yǎng)層，并觀察其增殖情況及1×105/凍存管凍存。
　　 2.逆轉錄病毒生產(chǎn)及病毒滴度測定
　　 逆轉錄病毒包

8、裝用QIANGEN質粒中量提取試劑盒對由中國科學院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院提供的攜帶Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc基因的Yamanaka質粒、EGFP質粒與病毒包裝質粒擴增并經(jīng)過嚴格測序無誤后，依據(jù)核酸以氯化鈣—DNA共沉淀物的形式出現(xiàn)時可使DNA附在細胞表面，利于細胞吞入攝取或通過細胞膜脂相收縮時裂開的空隙進入細胞內(nèi)的原理，按照以氯化鈣介導的轉染程序對293-T細胞進行逆轉錄病毒包裝，一般包裝48小時后收集病毒上清，經(jīng)病毒滴

9、度測定后于-80℃保存?zhèn)溆谩?br>　　 逆轉錄病毒滴度測定用5μl病毒上清感染15萬293-T細胞，48小時后用4％多聚甲醛固定，DAPI染色，熒光顯微鏡下計數(shù)EGFP陽性細胞和總細胞數(shù)，將其帶入公式:病毒滴度(IU/ml)=EGFP陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù)÷5×1.5×105×103。
　　 3.逆轉錄病毒載體法重編程慢性肝衰患者皮膚成纖維細胞為iPS細胞
　　 (1)取一定量的病毒上清于0.45μm濾器過濾后轉染慢性

10、肝衰患者皮膚成纖維細胞(在患者知情同意下，利用組織塊培養(yǎng)法獲得)。
　　 (2)病毒感染24小時后，將患者皮膚成纖維細胞消化并按照1×104/孔的6孔板中，6孔板預先接種好飼養(yǎng)層細胞，7天后按照10×104/10cm皿接種10cm培養(yǎng)皿中，人胚胎干細胞培養(yǎng)基持續(xù)培養(yǎng)至第10天，10天后開始換為iPS細胞條件培養(yǎng)基。
　　 (3)20天左右開始調(diào)取克隆，選擇AP陽性細胞繼續(xù)擴增培養(yǎng)。
　　 4.人iPS細胞建系及其

11、生物學特性鑒定
　　 (1)光學顯微鏡下觀察iPS細胞克隆形態(tài)并拍照保存;
　　 (2)利用細胞免疫熒光法檢測人胚胎干細胞標志性抗原表達;
　　 (3)提取iPS細胞總RNA，進而RT-PCR檢測人ES細胞標志性基因表達;
　　 (4)人iPS細胞核型分析;
　　 (5)懸浮培養(yǎng)觀察擬胚體形成及體外分化;
　　 (6)iPS細胞接種至SCID小鼠皮下，觀察畸胎瘤形成及體內(nèi)分化情況。

12、　　 結果:
　　 1.CF-1小鼠胚胎成纖維細胞飼養(yǎng)層制備
　　 孕13.5天胎鼠，0.15％的胰酶將其軀干消化為單個胚胎成纖維細胞，傳代培養(yǎng)至第三代，采用10mg/L濃度的絲裂霉素C處理2.5小時后，飼養(yǎng)層細胞能夠很好的維持iPS生長5-7天，并保持其未分化狀態(tài)。這符合干細胞生長特性。
　　 2.逆轉錄病毒包裝及病毒滴度測定
　　 攜帶Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4基因的逆轉錄病毒載體及E

13、GFP質粒與逆轉錄病毒包裝質粒利用鈣轉染的方法共轉染進293-T細胞以生產(chǎn)病毒，48小時后EGFP轉染對照組在倒置熒光顯微鏡下可見綠色熒光，提示轉染成功，并收集病毒上清。按照上述病毒滴度測定方法，病毒滴度值均在1×106IU/ml以上，同時表明病毒可轉染真核細胞。
　　 3.逆轉錄病毒載體法重編程慢性肝衰患者皮膚成纖維細胞為iPS細胞
　　 用攜帶Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4基因的逆轉錄病毒載體及轉染對照組E

14、GPF質粒的病毒上清各2ml感染肝衰患者皮膚成纖維細胞，24小時后種植于飼養(yǎng)層細胞上，并換為人iPS細胞誘導專用培養(yǎng)基持續(xù)培養(yǎng)至第十天;48-72小時后，EGFP對照組在倒置熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光，表示轉染成功，一般于轉染后第三天，成纖維細胞形態(tài)可發(fā)生變化，第七天左右可見ES樣克隆出現(xiàn)，第十天左右開始更換為iPS細胞條件培養(yǎng)基，第二十天左右挑取AP陽性克隆繼續(xù)擴增培養(yǎng)。
　　 4.人iPS細胞建系及其生物學特性鑒定
　

15、　 (1)一般在轉染后第7天左右，成纖維細胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，有ES樣克隆形成，第20左右可以挑取堿性磷酸酶(AP)陽性克隆繼續(xù)培養(yǎng);
　　 (2)2株人iPS細胞AP染色呈陽性，且具有典型的ES細胞樣克隆形態(tài);
　　 (3)2株人iPS細胞系表達ES細胞特有的標志性基因;
　　 (4)2株人iPS細胞系表達ES細胞特有的標志性抗原:SSAE-4，SSAE-1，TRA-1-60,TRA-1-81,Oct4;

16、r>　　 (5)2株人iPS細胞核型分析未見異常;
　　 (6)2株人iPS細胞系具有體外分化形成囊性擬胚體的能力，并表達各胚層的標志性基因;
　　 (7)2株人iPS細胞系均能形成畸胎瘤。
　　 結論:
　　 1.制備CF-1小鼠胚胎成纖維細胞飼養(yǎng)層的最佳胎齡為13.5天。絲裂霉素C抑制CF-1小鼠胚胎成纖維細胞增殖的最佳濃度及工作時間為10mg/L，2.5小時，成纖維細胞飼養(yǎng)層可以維持5-7天。誘導

17、多能性干細胞與胚胎干細胞在經(jīng)10mg/L絲裂霉素C處理2.5小時后飼養(yǎng)層上能發(fā)育成典型的“鳥巢”狀干細胞集落。
　　 2.利用鈣轉系統(tǒng)包裝的病毒滴度值均在1×106IU/ml以上，最佳感染復數(shù)為2ml/6孔板·孔，且其可以感染真核細胞。
　　 3.運用Oct4、Sox2、Klf4、和c-Myc四種基因能夠成功將慢性肝衰患者皮膚成纖維細胞體外重編程為iPS細胞。2株iPS細胞具有hES細胞的一些生物學特性，且在體外傳代過程