小鼠誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞系的建立與鑒定.pdf

1、胚胎干細(xì)胞具有自我更新及多向分化潛能，為發(fā)育學(xué)、遺傳學(xué)、人類(lèi)疾病的發(fā)病機(jī)理與替代治療等研究提供非常寶貴的資源。由于其應(yīng)用價(jià)值，科學(xué)家們?cè)鴩L試通過(guò)不同途徑實(shí)現(xiàn)體細(xì)胞重編程以獲取ES細(xì)胞或ES細(xì)胞樣的細(xì)胞或多潛能干細(xì)胞（Induced pluripotent stem cells，iPS cells），這些途徑主要包括體細(xì)胞核移植、體細(xì)胞與多潛能細(xì)胞融合后的重編程、將分化的體細(xì)胞在卵細(xì)胞或多潛能干細(xì)胞的抽提物中孵育以實(shí)現(xiàn)體細(xì)胞重編程、體細(xì)胞

2、經(jīng)特定因子誘導(dǎo)重編程為iPS細(xì)胞。雖然運(yùn)用前三種方法可以獲得多潛能干細(xì)胞，但是這些方法的廣泛應(yīng)用在技術(shù)、細(xì)胞來(lái)源、免疫排斥、倫理、宗教和法律等方面存在諸多限制，而iPS細(xì)胞不受這些問(wèn)題的限制，且制備簡(jiǎn)單易行；相對(duì)體細(xì)胞核移植技術(shù)而言，iPS細(xì)胞技術(shù)為體細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞重編程機(jī)制研究提供了理想而簡(jiǎn)便的體外研究體系，正因?yàn)閕PS細(xì)胞技術(shù)的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，以前采用體細(xì)胞核移植技術(shù)研究體細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞重編程機(jī)制的科學(xué)家紛紛放棄該技術(shù)，轉(zhuǎn)而采用iPS細(xì)胞

3、技術(shù)。 鑒于此，本試驗(yàn)擬借助慢病毒載體法將Oct4、Sox2、K1f4和c-Myc四種基因?qū)胄∈笈咛コ衫w維細(xì)胞（MEFs），進(jìn)而將其重編程為iPS細(xì)胞，以實(shí)現(xiàn)下列目標(biāo)：（1）熟練掌握基于慢病毒載體法將體細(xì)胞重編程為iPS細(xì)胞的技術(shù)，以為下一步利用iPS細(xì)胞技術(shù)研究腫瘤細(xì)胞重編程機(jī)制提供技術(shù)保障；（2）建立小鼠iPS細(xì)胞系，以為后續(xù)研究[如iPS細(xì)胞生物學(xué)特性和行為（如自我復(fù)制、增殖和分化等）調(diào)控機(jī)制研究）奠定基礎(chǔ)。 目

4、的： 借助慢病毒載體法將Oct4、Sox2、K1f4和c-Myc四種基因?qū)胄∈笈咛コ衫w維細(xì)胞（MEFs），進(jìn)而將其重編程為iPS細(xì)胞，以實(shí)現(xiàn)多種目的（見(jiàn)上）。 方法： 1慢病毒載體pHAGE2-EF1α-STEMMCA及pHAGE2-EF1aFull-ZsGreen-W的鑒定 酶切鑒定分別使用EcoRⅠ、KpnⅠ和EcoRⅠ、XhoⅠ對(duì)pHAGE2-EF1α-STEMMCA進(jìn)行酶切，分別使用EcoRⅠ、

5、PvuⅡ和BamHⅠ、XhoⅠ對(duì)pHAGE2-EF1aFull-ZsGreen-W進(jìn)行酶切；酶切產(chǎn)物進(jìn)行0.6％瓊脂糖凝膠電泳。 PCR鑒定根據(jù)Oct4、K1f4、c-Myc和Sox2序列設(shè)計(jì)引物分別擴(kuò)增Oct4、K1f4、c-Myc和Sox2基因；PCR擴(kuò)增后，取5μl反應(yīng)液進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳。 2慢病毒生產(chǎn)與成功生產(chǎn)鑒定 慢病毒包裝與濃縮按標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行慢病毒包裝（脂質(zhì)體介導(dǎo)的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染）、超速離心濃縮和保

6、存等。 慢病毒成功生產(chǎn)的鑒定用病毒上清或濃縮后的病毒感染293FT細(xì)胞，24～48h后熒光顯微鏡下觀察是否見(jiàn)綠色熒光。 3利用細(xì)胞模型在體外驗(yàn)證EGFP能否正常表達(dá) 用病毒上清感染MEFs，24～48h后熒光顯微鏡下觀察是否見(jiàn)綠色熒光。 4慢病毒載體法重編程MEFs為iPS細(xì)胞 用濃縮病毒感染攜帶有Pou5 f1-EGFP基因的MEFs，12h后棄病毒感染液，更換為鼠ES細(xì)胞培基，之后每天更換培基

7、直到第二十天克隆足夠大時(shí)挑克隆擴(kuò)大培養(yǎng)。 5鼠iPS細(xì)胞建系及其生物學(xué)特性鑒定 1）iPS細(xì)胞克隆上綠色熒光蛋白基因表達(dá)情況 2）所有iPS細(xì)胞系傳代培養(yǎng)至第5代后，進(jìn)行AKP染色鑒定； 3）提取iPS細(xì)胞總RNA，并進(jìn)而通過(guò)RT-PCR檢測(cè)鼠ES細(xì)胞標(biāo)志性基因表達(dá)； 4）懸浮培養(yǎng)觀察擬胚體形成及分化情況； 5）iPS細(xì)胞接種至SCID小鼠皮下，觀察畸胎瘤形成情況。 結(jié)果：

8、 1慢病毒載體pHAGE2-EF1α-STEMMCA及pHAGE2-EF1aFull-ZsGreen-W鑒定 酶切鑒定 pHAGE2-EF1α-STEMMCA及pHAGE2-EF1aFull-ZsGreen-W經(jīng)EcoRⅠ單酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)0.6％瓊脂糖凝膠電泳均可見(jiàn)一條預(yù)期大小的條帶；pHAGE2-EF1α-STEMMCA經(jīng)KpnⅠ單酶切和EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切酶切產(chǎn)物經(jīng)0.6％瓊脂糖凝膠電泳均可見(jiàn)兩條預(yù)期大小的條帶；pH

9、AGE2-EF1aFull-ZsGreen-W經(jīng)PvuⅡ單酶切和BamHⅠ、XhoⅠ雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)0.6％瓊脂糖凝膠電泳均可見(jiàn)兩條預(yù)期大小的條帶。 PCR鑒定以質(zhì)粒pHAGE2-EF1α-STEMMCA為模板，分別擴(kuò)增Oct4、K1f4、c-Myc和Sox2基因，PCR產(chǎn)物大小均與預(yù)期值相符。 2慢病毒包裝、濃縮及鑒定 攜帶EGFP基因慢病毒的生產(chǎn)與鑒定將pHAGE2-EF1aFull-ZsGreen-W與

10、病毒包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞，48h后倒置熒光顯微鏡下可見(jiàn)綠色熒光，預(yù)示轉(zhuǎn)染成功。用收集的病毒上清感染293FT細(xì)胞，48h后倒置熒光顯微鏡下可觀察到綠色熒光，這進(jìn)一步說(shuō)明病毒已成功生產(chǎn)：同時(shí)也表明EGFP轉(zhuǎn)基因能夠正常表達(dá)。 攜帶Oct4、K1f4、c-Myc和Sox2基因的慢病毒生產(chǎn)與鑒定將pHAGE2-EF1α-STEMMCA與病毒包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞，48h后倒置熒光顯微鏡下可見(jiàn)合包體和細(xì)胞融合現(xiàn)象，預(yù)示病毒

11、正在生產(chǎn)。 3利用細(xì)胞模型在體外驗(yàn)證EGFP能否正常表達(dá) 用攜帶EGFP基因的慢病毒感染MEFs，48h后在倒置熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光，這表明轉(zhuǎn)基因EGFP在MEFs內(nèi)能夠正常表達(dá)。 4慢病毒載體法重編程MEFs為iPS細(xì)胞 病毒感染后第4天可見(jiàn)到ES克隆出現(xiàn)，第20天克隆足夠大可以挑克隆以擴(kuò)大培養(yǎng)，預(yù)示著MEFs已開(kāi)始重編程。 5.iPS細(xì)胞生物學(xué)特性鑒定 1）第9天可見(jiàn)到有綠色熒光

12、的iPS細(xì)胞克隆出現(xiàn)； 2）4株iPS細(xì)胞系均具有典型的ES細(xì)胞克隆形態(tài)，AKP染色呈強(qiáng)陽(yáng)性； 3）4株iPS細(xì)胞系均表達(dá)ES細(xì)胞特有的標(biāo)志性基因； 4）4株iPS細(xì)胞系均具有體外分化形成囊性擬胚體的能力，且可以分化為心肌細(xì)胞； 5）4株iPS細(xì)胞系均能形成畸胎瘤。 結(jié)論： 1.運(yùn)用Oct4、K1f4、c-Myc和Sox2四種基因成功將MEFs重編程為iPS細(xì)胞。 2.4株iPS細(xì)