人類多能干細(xì)胞向巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)分化的研究.pdf

1、目的:利用人類多能干細(xì)胞(hESCs)與小鼠主動(dòng)脈-性腺-中腎(mAGM)區(qū)基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)以誘導(dǎo)分化產(chǎn)生造血細(xì)胞并建立高效巨噬細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化體系，探索共培養(yǎng)早期和晚期來源巨噬細(xì)胞的特征。并將hESCs來源和人臍帶血CD34+細(xì)胞來源的巨噬細(xì)胞進(jìn)行比較，檢測形態(tài)學(xué)和功能學(xué)的差異。此外，在不同條件刺激下，檢測不同來源巨噬細(xì)胞Toll樣受體（TLRs）表達(dá)的差異。
　　方法:實(shí)驗(yàn)一:將hESCs與AGM-S3（鼠AGM區(qū)來源的基質(zhì)細(xì)胞

2、系）基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)3天后進(jìn)一步懸浮培養(yǎng)，在bFGF、M-CSF等細(xì)胞因子的作用下懸浮培養(yǎng)14天，得到共培養(yǎng)早期來源巨噬細(xì)胞。將hESCs與AGM-S3細(xì)胞共培養(yǎng)14天，產(chǎn)生大量CD34+CD45+造血干祖細(xì)胞，繼而在多種細(xì)胞因子的誘導(dǎo)下懸浮培養(yǎng)14天，得到共培養(yǎng)晚期來源巨噬細(xì)胞。通過May-Grünwald Giemsa染色、流式表面抗原及功能檢測等方法對hESCs來源的巨噬細(xì)胞和人臍帶血CD34+細(xì)胞來源的巨噬細(xì)胞進(jìn)行比較鑒定。

3、>　　實(shí)驗(yàn)二:將hESCs與AGM-S3共培養(yǎng)早期和晚期來源巨噬細(xì)胞、臍帶血CD34+細(xì)胞來源巨噬細(xì)胞取出，在不同刺激條件作用下，利用q-PCR、werstern-blot等方法比較三種巨噬細(xì)胞TLRs的表達(dá)在基因和蛋白水平的差別。
　　結(jié)果:實(shí)驗(yàn)一:hESCs與AGM-S3共培養(yǎng)早期和共培養(yǎng)晚期細(xì)胞懸浮培養(yǎng)都可產(chǎn)生大量高純度的巨噬細(xì)胞。并且該體系獲得的共培養(yǎng)晚期巨噬細(xì)胞與人臍帶血CD34+細(xì)胞來源的巨噬細(xì)胞具有相似的表型和功能。

4、hiPSCs與AGM-S3，hESCs與hAGM共培養(yǎng)14天細(xì)胞運(yùn)用該體系也可產(chǎn)生大量巨噬細(xì)胞。
　　實(shí)驗(yàn)二:不同刺激條件下，巨噬細(xì)胞TLRs mRNA的表達(dá)譜不同。在同一刺激條件下的不同刺激時(shí)間，TLRs mRNA的表達(dá)也不相同。在LPS和LPS+IFN-γ刺激下，共培養(yǎng)早期來源巨噬細(xì)胞TLR2 mRNA表達(dá)尤其高，為共培養(yǎng)晚期來源巨噬細(xì)胞的2-3倍，為臍帶血CD34+來源巨噬細(xì)胞的5-6倍;而共培養(yǎng)晚期來源巨噬細(xì)胞和臍帶血CD

5、34+來源巨噬細(xì)胞在LPS和LPS+IFN-γ刺激下主要表達(dá)TLR2和TLR3 mRNA。在IFN-γ作用下，hESCs來源巨噬細(xì)胞主要表達(dá)TLR3 mRNA，且共培養(yǎng)早期來源巨噬細(xì)胞TLR3 mRNA表達(dá)水平略高于共培養(yǎng)晚期來源巨噬細(xì)胞，臍帶血CD34+來源巨噬細(xì)胞此時(shí)主要表達(dá)TLR7-9 mRNA。IL-4作用下6H，三種巨噬細(xì)胞TLR5 mRNA水平表達(dá)明顯高于上述3種刺激條件下TLR5 mRNA的表達(dá)，其他TLRs mRNA的表

6、達(dá)水平低于上述3種條件，并且在IL-4作用12小時(shí)達(dá)到最低，甚至低于未刺激細(xì)胞TLRs mRNA的表達(dá)水平。
　　結(jié)論:我們實(shí)驗(yàn)室成功建立了人類多能干細(xì)胞高效誘導(dǎo)分化產(chǎn)生巨噬細(xì)胞的體系，包括共培養(yǎng)早期和晚期來源巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)體系。并運(yùn)用該體系成功培養(yǎng)了hiPSCs來源的巨噬細(xì)胞和hESCs與hAGM（人AGM區(qū)來源的基質(zhì)細(xì)胞系）共培養(yǎng)產(chǎn)生的巨噬細(xì)胞。為進(jìn)一步研究人類早期巨噬細(xì)胞的發(fā)育、不同發(fā)育階段巨噬細(xì)胞的功能特性和建立相關(guān)疾病模