血液病患者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性研究.pdf

1、干細(xì)胞是具有自我更新和多向分化潛能的細(xì)胞群體。它是胚胎發(fā)育、成人細(xì)胞和各種組織再生的天然增殖單位，其特有的生物學(xué)特征及潛在生物學(xué)應(yīng)用價(jià)值使其成為了近年生物學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)課題。依據(jù)它來(lái)源的不同，可分為胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞。胚胎干細(xì)胞來(lái)源于胚囊內(nèi)層細(xì)胞，具有向人體各組織器官分化的全能性。成體干細(xì)胞是存在于胎兒和出生后個(gè)體不同組織中的具有自我更新、多向分化潛能和增殖特性的細(xì)胞。胚胎干細(xì)胞具有胚胎發(fā)育的全能性并且具有種系傳遞的功能，可在體外進(jìn)行

2、遺傳操作，因而在一些疾病的治療中有著巨大的潛力。但是胚胎干細(xì)胞的分化機(jī)制目前還不清楚，在臨床的應(yīng)用中存在腫瘤發(fā)生的潛在風(fēng)險(xiǎn)，而且涉及了許多倫理方面的問(wèn)題，因此成人干細(xì)胞成為繼胚胎干細(xì)胞后新的研究熱點(diǎn)。最近，成體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成為成體干細(xì)胞研究的熱點(diǎn)。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞不僅具有多向分化和支持造血的功能，而且具有免疫抑制和誘導(dǎo)免疫耐受的作用，因此具有廣闊的臨床應(yīng)用潛能。但是，某些疾病狀態(tài)是否影響骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)性狀?化療藥物是否對(duì)間

3、充質(zhì)干細(xì)胞造成損傷及其程度如何?動(dòng)員后的外周血中除了造血干細(xì)胞外，是否還存在其它干細(xì)胞群體?對(duì)上述問(wèn)題的闡釋是本研究論文的主要目的。 第一部分 血液病患者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離純化、體外擴(kuò)增、多向分化和支持造血的研究 目的研究血液病患者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymalstemcells，MSCs)的生物學(xué)特征及其支持造血的功能。方法獲取急性髓細(xì)胞性自血病(acutemyelogenousleukemia，

4、AML；n=15)、急性淋巴細(xì)胞白血病(acutelymphoblasticleukemia，ALL；n=12)、慢性粒細(xì)胞性白血病(chronicmyelogenousleukemia，CML；n=20)、非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkinlymphoma，NHL；n=21)、霍奇金淋巴瘤(Hodgkindisease，HD；n=5)、骨髓增生異常綜合征(myelodysplasticsyndrome，MDS；n=7)患者的骨髓M

5、SCs，同時(shí)以8例正常人的骨髓MSCs作為正常對(duì)照。將獲取的MSCs用低血清培養(yǎng)液培養(yǎng)。瑞氏染色觀察形態(tài)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其免疫表型，通過(guò)油紅O染色、Vonkossa染色、RT-PCR和Western印跡檢測(cè)MSCs向脂肪、骨和神經(jīng)的分化。對(duì)不同來(lái)源血液病患者骨髓MSCs進(jìn)行染色體分析。通過(guò)集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)血液病患者M(jìn)SCs支持造血的功能。結(jié)果ALL、CML、NHL、HD、MDS骨髓MSCs具有相似的細(xì)胞形態(tài)、免疫表型及正常核型，而且都可

6、以向骨、脂肪和神經(jīng)細(xì)胞分化。AML骨髓MSCs在體外生長(zhǎng)緩慢，很難傳代培養(yǎng)，而其它來(lái)源骨髓MSCs增殖快，易于傳代培養(yǎng)。AML骨髓MSCs喪失多向分化能力。ALL、CML、NHL、HD骨髓MSCs具有和正常成人骨髓MSCs相似的支持造血功能，并且表達(dá)造血因子，雖然MDS骨髓MSCs也表達(dá)造血因子，但是其支持造血能力降低，AML來(lái)源的MSCs不具有支持造血的能力.結(jié)論血液病患者骨髓中存在具有間充質(zhì)干細(xì)胞特性的細(xì)胞群體。AML骨髓MSCs在

7、增殖、分化和支持造血方面存在病理改變；MDS骨髓MSCs在支持造血方面存在病理改變。 第二部分 化療藥物對(duì)骨髓問(wèn)充質(zhì)干細(xì)胞的損傷作用的研究 目的探討不同化療藥物對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymalstemcells，MSCs)增殖、分化和支持造血能力的影響。方法獲取正常成人骨髓MSCs(n=8)。用不同濃度化療藥物(環(huán)磷酰胺，cyclophasphomide，CTX；馬利蘭，busulphan，BU；阿糖胞

8、苷，cytarabine，Ara-c；柔紅霉素，daunorubicin，DNR；長(zhǎng)春新堿，vincristine，VCR；足葉乙甙，etoposide，VP-16；甲氨碟呤，methotraxate，MTX；地塞米松，dexamethasone，DXM)對(duì)MSCs進(jìn)行處理。檢測(cè)化療藥物對(duì)MSCs的增殖、調(diào)亡作用及化療藥物撤除后MSCs的恢復(fù)能力；體外誘導(dǎo)藥物處理MSCs向脂肪和骨分化，通過(guò)油紅O和VonKossa染色鑒定。RT-PCR

9、檢測(cè)藥物處理MSCs造血因子的表達(dá)；通過(guò)集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)藥物處理MSCs支持造血的功能。結(jié)果不同濃度的CTX、MTX和BU均不對(duì)骨髓MSCs造成損傷，而VCR、DNR、VP-16、Ara-c和DXM不同程度誘導(dǎo)骨髓MSCs調(diào)亡，并且抑制骨髓MSCs的增殖，其中VCR和DXM的抑制作用可以逆轉(zhuǎn)，而DNR、VP-16和Ara-c對(duì)MSCs的抑制作用持續(xù)存在?；熕幬锾幚砗驧SCs仍具有多向分化能力，可以在體外分化為脂肪和成骨細(xì)胞。化療藥物處