雞胚原始生殖細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化及其嵌合體的制備.pdf

1、原始生殖細(xì)胞(Primordial germ cells，PGCs)是生殖母細(xì)胞的前體細(xì)胞，是精子或卵子的祖先細(xì)胞，其作為一種多能干細(xì)胞，具有與胚胎干細(xì)胞相似的形態(tài)及分化潛能，能在體外進(jìn)行培養(yǎng)、傳代，并在一定條件下保持未分化的二倍體狀態(tài)及其多能性，具有形成嵌合體動(dòng)物的能力。本研究采用EDTA-酶解法提取發(fā)育至第19期和第28期雞胚胎性腺中的PGCs，經(jīng)過(guò)體外培養(yǎng)、傳代后，利用不同特異性化學(xué)物質(zhì)分別對(duì)第3代PGCs進(jìn)行體外定向誘導(dǎo)，以此探

2、討PGCs體外誘導(dǎo)分化的最優(yōu)條件。另外，本實(shí)驗(yàn)初步探索通過(guò)顯微注射法將供體雞胚PGCs注射至受體雞胚，從而制備嵌合體雞的方法。本研究實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)將為PGCs用于基因組學(xué)研究、藥物篩選等提供有價(jià)值的參考依據(jù)。研究結(jié)果如下： 1．以地塞米松、β-甘油磷酸鈉、維生素C為誘導(dǎo)劑，誘導(dǎo)PGCs向成骨細(xì)胞分化，比較以上各種誘導(dǎo)劑不同濃度和不同組合形成的誘導(dǎo)液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ，均能誘導(dǎo)產(chǎn)生成骨細(xì)胞，其誘導(dǎo)率為47％～79％。其中，誘導(dǎo)劑Ⅰ和誘導(dǎo)劑Ⅱ

3、誘導(dǎo)分化的效果最好，兩者之間無(wú)顯著差異(P>0.05)，但極顯著高于誘導(dǎo)劑Ⅲ、Ⅳ(P<0.01)，而誘導(dǎo)劑Ⅲ和誘導(dǎo)劑Ⅳ之間也存在極顯著差異(P<0.01)。在使用同一種誘導(dǎo)分化劑的情況下，兩個(gè)時(shí)期PGCs的誘導(dǎo)分化率差異不顯著(P>0.05)。誘導(dǎo)21d后細(xì)胞經(jīng)堿性磷酸酶(ALP)染色、鈣結(jié)節(jié)Von Kossa’s染色鑒定、免疫化學(xué)染色檢測(cè)I型膠原(Collagen I)表達(dá)，均呈強(qiáng)陽(yáng)性，說(shuō)明誘導(dǎo)后細(xì)胞是成骨細(xì)胞。 2．以地塞米

4、松、胰島素、IBMX為誘導(dǎo)劑，誘導(dǎo)．PGCs向脂肪細(xì)胞分化，比較以上各種誘導(dǎo)劑不同濃度和不同組合形成的誘導(dǎo)液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ，除誘導(dǎo)劑Ⅴ外，均能誘導(dǎo)產(chǎn)生75％～89％的脂肪細(xì)胞。其中，誘導(dǎo)劑Ⅰ+Ⅴ的誘導(dǎo)分化效果最好，與誘導(dǎo)劑Ⅰ、Ⅱ差異極顯著(P<0.01)。此外，誘導(dǎo)劑Ⅰ、Ⅱ兩者之間差異不顯著(P>0.05)，但是PGCs加入誘導(dǎo)劑I后出現(xiàn)脂肪細(xì)胞的時(shí)間較誘導(dǎo)劑Ⅱ早1～2天。誘導(dǎo)劑Ⅲ、Ⅳ的脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)效果無(wú)顯著差異(P>0.05)，但

5、與誘導(dǎo)劑Ⅰ、Ⅱ以及Ⅰ+Ⅴ存在極顯著差異(P<0.01)；誘導(dǎo)劑V的誘導(dǎo)分化率僅為1％～2％，與其他各組差異極顯著(P<0.01)。在使用同一種誘導(dǎo)分化劑的情況下，兩個(gè)時(shí)期：PGCs的誘導(dǎo)分化率差異不顯著(P>0.05)。誘導(dǎo)21d后細(xì)胞經(jīng)油紅O染色為橙紅色；此外，根據(jù)PPAR-γ基因設(shè)計(jì)一對(duì)引物，預(yù)擴(kuò)增301bp的片段，誘導(dǎo)后的細(xì)胞經(jīng)RT-PCR驗(yàn)證，出現(xiàn)目的條帶，說(shuō)明誘導(dǎo)后細(xì)胞中有PPAR-γ表達(dá)，證明雞PGCs在體外誘導(dǎo)分化后具有明

6、確的向脂肪細(xì)胞分化的能力。 3．以維甲酸、IBMX為誘導(dǎo)劑，誘導(dǎo)PGCs向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化，比較以上各種誘導(dǎo)劑不同濃度和不同組合形成的誘導(dǎo)液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，均能誘導(dǎo)PGCs產(chǎn)生75％～87％的神經(jīng)元樣細(xì)胞。誘導(dǎo)劑Ⅰ、Ⅱ誘導(dǎo)分化的效果最好，兩者之間無(wú)顯著差異(P>0.05)，但與誘導(dǎo)劑Ⅲ之間差異極顯著(P<0.01)。由此可見，RA、IBMX的單獨(dú)使用對(duì)神經(jīng)元樣細(xì)胞的形成率極顯著高于RA與IBMX聯(lián)合使用的效果。在使用同一種誘導(dǎo)分化劑的情況下

7、，兩個(gè)時(shí)期PGCs的誘導(dǎo)分化率差異不顯著(P>0.05)。誘導(dǎo)4d后細(xì)胞行甲苯胺藍(lán)染色，可見藍(lán)紫色的尼氏體。免疫組化法檢測(cè)誘導(dǎo)后細(xì)胞的神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)、神經(jīng)絲蛋白(NF)和膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)的表達(dá)，結(jié)果為NSE與NF呈陽(yáng)性，GFAP呈陰性，證明PGCs定向誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞。 4．本研究分別將供體(黑羽烏骨雞)PGCs顯微注射移植到40只受體(蘇禽黃雞)種蛋的雞胚胚下腔中，僅有2只孵化至18 d，但是