17β-雌二醇對壽光雞原始生殖細(xì)胞發(fā)育的影響.pdf

1、原始生殖細(xì)胞(primordial germ cells，PGCs)作為生殖干細(xì)胞，是禽類地方稀有品種遺傳資源保存及通過轉(zhuǎn)基因改良禽類品種的重要載體細(xì)胞。因此，PGCs的體內(nèi)外發(fā)育研究，對建立禽類生殖腺嵌合體和轉(zhuǎn)基因技術(shù)平臺(tái)具有重要意義。17β-雌二醇(17β-estradiol，17β-E2)作為一種雌性激素，對多種細(xì)胞體細(xì)胞和生殖細(xì)胞的增殖具有重要促進(jìn)作用。本研究以壽光雞28期胚胎為試驗(yàn)材料，探討了17β-E2對體內(nèi)外性腺原始生殖細(xì)

2、胞(Gonadal primordial germ cells，gPGCs)發(fā)育的影響。首先，制作28期雞胚性腺組織切片，進(jìn)行PAS和HE染色，并在顯微鏡下進(jìn)行形態(tài)鑒定;其次，雞胚發(fā)育到第X期，用雞蛋開窗法注入17β-E2，封口孵化至28期，用EDTA-胰酶解離法消化性腺組織，分離獲得gPGCs，觀察和分析17β-E2對gPGCs體內(nèi)發(fā)育的影響;第三，孵化至28期胚胎（未經(jīng)17β-E2處理），分離性腺，將分離的PGCs和性腺基質(zhì)細(xì)胞共培

3、養(yǎng)，根據(jù)差速貼壁原理分離純化PGCs，培養(yǎng)于添加不同濃度17β-E2的培養(yǎng)液，觀察和分析17β-E2對gPGCs體外發(fā)育的影響。試驗(yàn)結(jié)果如下:
　　 1、PGCs形態(tài)學(xué)研究
　　 組織切片觀察表明，gPGCs呈圓形或卵圓形，有偽足，直徑為10μm-15μm，胞核呈圓形或橢圓形，偏向細(xì)胞邊緣，大小為5μm-7.5μm。核內(nèi)緣有少量異染色質(zhì)，常染色質(zhì)均勻分布。分離后的細(xì)胞懸液涂片觀察表明，游離的gPGCs呈圓形或卵圓形，有偽

4、足，周圍有明顯的光環(huán)，直徑為12.5μm-20μm。
　　 2、17β-E2對PGCs體內(nèi)發(fā)育的影響
　　 17β-E2處理組雞胚的PGCs數(shù)量（1601±126個(gè)/枚）顯著高于(P＜0.05)注射乳化劑對照組（1327.5±210.4個(gè)/枚）和未注射乳化劑對照組（1401.80±312.5個(gè)/枚）。
　　 3、PGCs的分離純化
　　 分離未經(jīng)17β-E2處理的28期壽光雞胚胎性腺，經(jīng)酶消化，總細(xì)胞數(shù)為

5、(8.7±1.7)×104個(gè)/枚，其中g(shù)PGCs數(shù)量為1401.80±312.5個(gè)/枚，占總細(xì)胞數(shù)的1.61％。將分離后的gPGCs與性腺基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)，經(jīng)24h培養(yǎng)差速貼壁分離，獲得總細(xì)胞數(shù)為1542±589個(gè)/枚，其中g(shù)PGCs為432.5±106.5個(gè)/枚，回收率為36.52±4.86％，純度為28.1±1.9％，存活率71.7±2.2％。
　　 4、17β-E2對體外培養(yǎng)壽光雞原始生殖細(xì)胞的影響
　　 將分離純化

6、的PGCs分別培養(yǎng)于添加不同濃度(0ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL)17β-E2的TCM199基礎(chǔ)培養(yǎng)液中，培養(yǎng)1～6天。結(jié)果顯示，5ng/mL添加組與0ng/mL添加組比較，PGCs的發(fā)育能力無顯著差異，而10ng/mL和20ng/mL添加組與0ng/mL及5ng/mL添加組比較，PGCs的發(fā)育能力差異顯著(P＜0.05)。但是，10ng/mL和20ng/mL添加組之間比較，PGCs的發(fā)育能力無顯著差異。