17β-雌二醇對(duì)小鼠肺成纖維細(xì)胞的影響研究.pdf

1、目的：觀察17β-雌二醇（17β-E2）對(duì)小鼠肺成纖維細(xì)胞內(nèi)小凹蛋白（Caveolin-1）的表達(dá)以及細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的影響改變，是否可以降低Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白的表達(dá)，探討17β-E2抗肺纖維化的作用，為進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)提供理論依據(jù)。
　　方法：取液氮下凍存的小鼠成纖維細(xì)胞，37℃水浴復(fù)蘇1min后接種于含體積分?jǐn)?shù)為10％的血清、體積分?jǐn)?shù)

2、為1%雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基中，于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h、3d、5d后，通過(guò)倒置相差顯微鏡觀察小鼠成纖維細(xì)胞形態(tài)變化；用濃度為20mg/L、50mg/L和100mg/L的SiO2刺激小鼠肺泡巨噬細(xì)胞24h，產(chǎn)生的上清液經(jīng)離心提取后-20℃環(huán)境備用；根據(jù)SiO2濃度、17β-E2濃度以及17β-E2的干預(yù)時(shí)間三因素三水平，運(yùn)用正交設(shè)計(jì)分為9組進(jìn)行MTT增殖實(shí)驗(yàn)，確定17β-E2最佳的作用濃度和時(shí)間；依據(jù)正交設(shè)計(jì)的結(jié)果

3、將細(xì)胞進(jìn)行分成5組進(jìn)行處理，即空白對(duì)照組、SiO2組、SiO2+10-8mol/L濃度的17β-E2組（低濃度17β-E2干預(yù)組）、SiO2+10-7mol/L濃度的17β-E2組（中濃度17β-E2干預(yù)組）和SiO2+10-6mol/L濃度的17β-E2組（高濃度17β-E2干預(yù)組）；每組細(xì)胞處理后依次運(yùn)用 MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖，流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡，激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度變化和免疫組織化學(xué)法測(cè)量細(xì)胞內(nèi) Ca

4、veolin-1、ERK、Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)情況。
　　結(jié)果：1、形態(tài)學(xué)變化：取剛復(fù)蘇的小鼠成纖維細(xì)胞放置于倒置相差顯微鏡下，以倍數(shù)為10×10鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞多呈圓球形且高度折光，懸浮在培養(yǎng)液中。細(xì)胞約24h后開始貼壁，細(xì)胞多呈梭狀，偶見三角形或多角形，約3d左右細(xì)胞可布滿培養(yǎng)瓶70%到80%的面積，約5d左右可鋪滿整個(gè)培養(yǎng)瓶瓶壁，折光度明顯降低，呈“鋪路石”般的致密狀，適時(shí)可以進(jìn)行傳代培養(yǎng)。2、正交設(shè)計(jì)：正交設(shè)計(jì)的方差分析

5、，結(jié)果顯示：不同濃度的SiO2、17β-E2以及17β-E2的干預(yù)時(shí)間均對(duì)細(xì)胞增殖預(yù)實(shí)驗(yàn)影響差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；進(jìn)一步對(duì)正交設(shè)計(jì)結(jié)果進(jìn)行極差分析，其結(jié)果顯示：對(duì)MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)的影響最大的是因素SiO2濃度，其次為17β-E2濃度，最低為17β-E2的干預(yù)時(shí)間，最佳配對(duì)因素SiO2、17β-E2的濃度和17β-E2干預(yù)時(shí)間分別為20mg/L、10-6mol/L和24h。3、細(xì)胞增殖：與空白組對(duì)照組比較，在加入 SiO2刺

6、激得來(lái)的上清液后，SiO2組的細(xì)胞吸光度值明顯升高（P<0.05）；加入干預(yù)劑17β-E2后，干預(yù)組的吸光度值較 SiO2組明顯降低，且隨著干預(yù)劑17β-E2濃度的增加，吸光度值越加降低（P<0.05）。4、細(xì)胞周期：與空白對(duì)照組比較，在加入 SiO2刺激得來(lái)的上清液后，SiO2組 G2和S期的細(xì)胞比例明顯增加，G1期的細(xì)胞比例明顯減少（P<0.05）；使用干預(yù)劑17β-E2后，干預(yù)組G2和S期的細(xì)胞比例較 SiO2組明顯減少，G1期的

7、細(xì)胞比例明顯增多（P<0.05）；且隨著17β-E2的濃度升高，G1期的細(xì)胞比例明顯增多，G2和S期的細(xì)胞比例明顯減少（P<0.05）。5、細(xì)胞凋亡：與正常對(duì)照組的細(xì)胞比較，SiO2組的小鼠肺成纖維細(xì)胞凋亡率顯著降低（P<0.05）；在加入17β-E2后，與 SiO2組進(jìn)行比較，處于凋亡晚期的細(xì)胞比例增多（P<0.05），并隨著雌二醇濃度的升高，凋亡細(xì)胞比例的增高越加明顯（P<0.05）。6、免疫組織化學(xué)法：與空白對(duì)照組比較，SiO2組

8、細(xì)胞內(nèi)的ERK、Ⅰ和Ⅲ膠原表達(dá)大量增加（P<0.05），在加入干預(yù)劑17β-E2后，與 SiO2組進(jìn)行比較，干預(yù)組細(xì)胞內(nèi)的小凹蛋白表達(dá)增加，而 ERK、Ⅰ和Ⅲ型膠原的表達(dá)在減少（P<0.05）；且隨著雌二醇濃度的增高，小凹蛋白的表達(dá)增加越明顯，ERK、Ⅰ和Ⅲ型膠原的表達(dá)減少的也越明顯（P<0.05）。7、激光光共聚焦：與空白對(duì)照組比較，SiO2組內(nèi)細(xì)胞的熒光強(qiáng)度增高，呈強(qiáng)熒光的狀態(tài)（P<0.05）。加入干預(yù)劑17β-E2后，干預(yù)組內(nèi)細(xì)胞

9、的熒光強(qiáng)度較 SiO2組明顯減弱（P<0.05）；隨著17β-E2濃度的增高，與 SiO2組比較，其細(xì)胞的熒光強(qiáng)度明顯越弱，呈弱熒光表達(dá)（P<0.05），但與空白對(duì)照組比較仍然高出（P<0.05）。
　　結(jié)論：1、17β-E2能通過(guò)阻滯小鼠肺成纖維細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期和G2期來(lái)抑制SiO2引起的細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡。2、17β-E2可誘導(dǎo)小凹蛋白表達(dá)，并抑制成纖維細(xì)胞內(nèi)ERK蛋白、Ⅰ、Ⅲ型膠原的表達(dá)。3、17β-E2能抑制SiO2