DAPT對(duì)肺成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化中Wnt信號(hào)通路影響研究.pdf

1、目的:
　　研究γ-分泌酶抑制劑DAPT阻斷Notch信號(hào)通路后，Wnt信號(hào)通路中的wnt1、β-catenin及肌成纖維細(xì)胞標(biāo)志因子α-SMA的表達(dá)變化，探討Wnt/β-catenin信號(hào)通路與Notch信號(hào)通路之間存在直接或間接的相互作用以及Wnt/β-catenin信號(hào)通路在DAPT抑制肺成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化中的作用表達(dá)。
　　方法:
　　(1)從出生2-3天SD大鼠的幼鼠中取得肺組織，采用胰酶消化法分離培養(yǎng)出肺成

2、纖維細(xì)胞，并使用波形蛋白(Vimentin)免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)培養(yǎng)至第三代肺成纖維細(xì)胞的純度;(2)予無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)基同步培養(yǎng)細(xì)胞24h，并將其分為對(duì)照組、TGF-β1組、TGF-β1+DAPT組;(3)分別在TGF-β1組和TGF-β1+DAPT組中加入5ng/ml TGF-β1誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，并在TGF-β1+DAPT組中加入500nmol/L的DAPT抑制纖維細(xì)胞增殖，并作用于肺成纖維細(xì)胞24h，觀察其形

3、態(tài)學(xué)改變;(4)分別采用RT-PCR法檢測(cè)α-SMA、wnt1及β-catenin的mRNA表達(dá)變化，Western blot法檢測(cè)β-catenin的蛋白表達(dá)變化;(5)采用SPASS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩樣本均數(shù)間比較采用t檢驗(yàn)，多樣本間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。
　　結(jié)果:
　　(1) Vimentin免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè):幾乎所有第三代細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)均可見棕黃色顆粒，證明使用胰酶

4、消化至第三代細(xì)胞幾乎全為肺成纖維細(xì)胞;(2)α-SMAmRNA表達(dá):對(duì)照組α-SMA mRNA值(0.385±0.015)、TGF-β1組（0.615±0.025）、TGF-β1+DAPT組(0.345±0.027)，其中TGF-β1組α-SMA mRNA值較對(duì)照組和TGF-β1+DAPT組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)，但對(duì)照組較TGF-β1+DAPT組無(wú)明顯差異，即差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05);(3) wnt1 mR

5、NA值表達(dá):對(duì)照組wnt1 mRNA值（0.233±0.005）、TGF-β1組（0.257±0.010）、TGF-β1+DAPT組（0.209±0.016），可知TGF-β1組wnt1 mRNA值較對(duì)照組和TGF-β1+DAPT組顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05);(4)β-catenin mRNA和蛋白表達(dá):對(duì)照組β-catenin mRNA和蛋白相對(duì)吸光光度值（0.984±0.031和0.352±0.023）、TGF-β1

6、組（1.248±0.021和0.431±0.014）、TGF-β1+DAPT組（0.895±0.056和0.102±0.024），可見TGF-β1組較對(duì)照組和TGF-β1+DAPT組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　(1) TGF-β1可誘導(dǎo)肺成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，在轉(zhuǎn)化過(guò)程中α-SMA、β-catenin、wnt1表達(dá)增高;(2) DAPT阻斷Notch信號(hào)通路后，影響了成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)