脂多糖誘導(dǎo)肺成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變及異常增殖的機制研究.pdf

1、肺纖維化是急性肺損傷（acute lung injury, ALI）和急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome, ARDS）發(fā)展的重要病理階段，以肺成纖維細(xì)胞異常增殖、活化并分泌膠原蛋白，形成肺間質(zhì)和肺泡內(nèi)彌散性纖維化為特點。革蘭氏陰性桿菌細(xì)胞壁的脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）可以作用于肺成纖維細(xì)胞的特異性受體—Toll樣受體4（Toll-like recept

2、or4, TLR4），并直接引起肺成纖維細(xì)胞的活化和增殖，與肺纖維化發(fā)生密切相關(guān)。然而 LPS對成纖維細(xì)胞增殖作用的研究結(jié)果很不一致，提示不同來源的成纖維細(xì)胞亞型可能因存在著不同的表型而產(chǎn)生異質(zhì)性（heterogeneity），其可能是細(xì)胞對LPS刺激產(chǎn)生不同生物學(xué)效應(yīng)的重要原因。
　　Thy-1是成纖維細(xì)胞表面由糖磷脂酰肌醇錨定的糖蛋白，根據(jù)細(xì)胞表面胸腺細(xì)胞分化抗原-1（thymocyte differentiation ant

3、igen1, Thy-1）表達(dá)的情況，可以將肺成纖維細(xì)胞分為Thy-1(＋)及Thy-1(－)兩種不同的表型。Thy-1在正常肺成纖維細(xì)胞表面大量表達(dá)，但是在特發(fā)性肺纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis, IPF）患者肺組織存在著大量Thy-1呈陰性表達(dá)的Thy-1(－)肺成纖維細(xì)胞。Thy-1(-)的肺成纖維細(xì)胞在各種致纖維化因子刺激下具有更活躍的反應(yīng)能力，與肺纖維化的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。有研究表明Thy

4、-1基因表達(dá)受組蛋白去乙酰化等表觀遺傳學(xué)機制的調(diào)控，也有研究表明LPS可以通過組蛋白去乙酰化等表觀遺傳學(xué)機制調(diào)控多種基因的表達(dá)。但是，目前尚未明確LPS是否通過表觀遺傳調(diào)控作用抑制肺成纖維細(xì)胞Thy-1基因的表達(dá)而改變細(xì)胞的表型，引起肺成纖維細(xì)胞的增殖。
　　本課題擬利用LPS誘導(dǎo)肺成纖維細(xì)胞增殖的模型，首先明確LPS直接誘導(dǎo)原代培養(yǎng)的Thy-1(＋)肺成纖維細(xì)胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)變的和異常增殖的作用；隨后通過RNAi技術(shù)抑制肺成纖維細(xì)胞

5、TLR4的表達(dá)，研究LPS通過TLR4對肺成纖維細(xì)胞Thy-1基因表達(dá)以及細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變和異常增殖的表觀遺傳學(xué)調(diào)控作用。
　　第一部分,脂多糖誘導(dǎo)肺成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變的作用研究
　　目的：明確在急性肺損傷肺纖維化早期，脂多糖（LPS）誘導(dǎo)肺成纖維細(xì)胞增殖及表型轉(zhuǎn)變的作用。
　　方法：原代培養(yǎng)小鼠肺成纖維細(xì)胞，以終濃度為0.01μg/ml、0.1μg/ml和1μg/ml的LPS刺激細(xì)胞，并設(shè)陰性對照；LPS作用0h、6h、

6、24h、48h和72h后以CCK-8（cell counting kit-8）細(xì)胞計數(shù)試劑盒檢測細(xì)胞增殖情況，以real-time PCR檢測各組細(xì)胞Thy-1 mRNA的動態(tài)表達(dá)情況。
　　結(jié)果：原代培養(yǎng)的小鼠肺成纖維細(xì)胞Thy-1基因呈陽性表達(dá)；以不同濃度LPS刺激細(xì)胞最初24小時內(nèi)未見細(xì)胞明顯增殖，48-72小時后細(xì)胞增殖速率顯著增加，同時伴有Thy-1基因表達(dá)量顯著下降，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)檢驗差異存在顯著性（P<0.05）。相對于0

7、.01μg/ml和0.1μg/ml兩個濃度，以1μg/ml的LPS刺激細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞增殖及Thy-1基因表達(dá)下調(diào)的反應(yīng)更為顯著。
　　結(jié)論：LPS可通過抑制肺成纖維細(xì)胞Thy-1基因的表達(dá)而使細(xì)胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)變并引起異常增殖。
　　第二部分,小鼠肺成纖維細(xì)胞TLR4 siRNA序列的設(shè)計和siRNA慢病毒載體的構(gòu)建
　　目的：設(shè)計、構(gòu)建和鑒定TLR4-RNAi慢病毒載體（Lentivirus-TLR4-siRNA）用于后

8、續(xù)實驗。
　　方法：設(shè)計、制備3個針對TLR4基因的siRNA質(zhì)粒并進行慢病毒包裝。轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)的小鼠肺成纖維細(xì)胞后通過Real-time PCR篩選RNA干擾最佳靶點。
　　結(jié)果：經(jīng)PCR鑒定和測序驗證，成功構(gòu)建了3個針對的TLR4基因的siRNA質(zhì)粒并進行慢病毒包裝，形成TLR4- RNAi慢病毒載體（Lentivirus-TLR4-siRNA）；經(jīng)Real-time PCR篩選出最佳TLR4-RNAi慢病毒載體（Tar

9、get2＃），其病毒滴度測定結(jié)果為8×107TU/ml，抑制效率約80%。
　　結(jié)論：針對TLR4基因的Lentivirus-TLR4-siRNA能有效抑制原代培養(yǎng)的小鼠肺成纖維細(xì)胞TLR4基因的表達(dá)，用于后續(xù)實驗。
　　第三部分,脂多糖調(diào)控Thy-1(＋)肺成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變及異常增殖的機制
　　目的：明確脂多糖調(diào)控Thy-1(＋)肺成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變及異常增殖的機制。
　　方法：利用LPS誘導(dǎo)肺成纖維細(xì)胞增殖

10、模型，首先觀察 LPS刺激原代培養(yǎng)的Thy-1(＋)肺成纖維細(xì)胞0-72小時細(xì)胞增殖及Thy-1基因表達(dá)的動態(tài)變化過程。隨后深入研究LPS誘導(dǎo)Thy-1(＋)肺成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變的表觀遺傳學(xué)機制，重點探討LPS通過TLR4的活化對肺成纖維細(xì)胞Thy-1基因啟動區(qū)組蛋白乙?；揭约凹?xì)胞Thy-1基因表達(dá)的影響，并嘗試通過RNAi技術(shù)抑制肺成纖維細(xì)胞TLR4的表達(dá)從而抑制由LPS引起的Thy-1基因沉默現(xiàn)象。
　　結(jié)果：BrdU檢測

11、發(fā)現(xiàn)：以1μg/ml濃度 LPS刺激細(xì)胞最初24小時內(nèi)未見細(xì)胞明顯增殖，48-72小時后細(xì)胞增殖速率顯著增加。
　　real-time PCR及Western-blot檢測發(fā)現(xiàn)：原代培養(yǎng)的小鼠肺成纖維細(xì)胞Thy-1基因呈陽性表達(dá)；以LPS刺激細(xì)胞最初24小時內(nèi)Thy-1基因及蛋白表達(dá)量開始下降；LPS刺激48-72小時后Thy-1基因及蛋白表達(dá)量顯著下降。
　　real-time PCR及Western-blot檢測發(fā)現(xiàn)：以

12、LPS刺激肺成纖維細(xì)胞72小時可引起細(xì)胞Thy-1基因及蛋白表達(dá)量顯著下降，但是細(xì)胞在轉(zhuǎn)染TLR4 siRNA慢病毒載體抑制TLR4表達(dá)后，以上過程被抑制。
　　Western-blot檢測發(fā)現(xiàn)：以LPS刺激肺成纖維細(xì)胞72小時可引起細(xì)胞乙?；M蛋白H3及H4（Ace-H3, Ace-H4）表達(dá)量顯著下降，提示組蛋白乙酰化程度降低。但是細(xì)胞在轉(zhuǎn)染TLR4 siRNA慢病毒載體抑制TLR4表達(dá)后，以上過程被抑制。
　　結(jié)論：L